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(無題) 削除/引用 No.1176-10 - 2010/05/13 (木) 14:23:04 - （無題） わたしはECL advanceを使って、転写面を下にして発光検出液は50cm2当たり4mLくらいで2−5分フィルムかプラスチックトレイの上で反応させています。 その後、半分に折ったキムワイプを下を3枚、上を2枚くらいで濡れた膜を挟んで反応液を除きます（乾燥させても問題ありません＋斑点などの汚れも生じませんよ）。だたし、濡れたキムワイプは厳禁です（むらや斑点が生じます）。 その後、適当な大きさに切ったクリアポケット（100均で売ってます）に挟んでCCDカメラで数十秒間露光して撮影します。 いろいろ試しましたが、私としてはこの方法が一番安定して高感度に検出できています。

(無題) 削除/引用 No.1176-9 - 2008/07/21 (月) 03:49:55 - 名無し 洗いのときの液量すくないからとおもうつまり洗いのムラ。液少なくてタッパー水平でなかったりするとなる。あと見ていないときに膜がはずみでタッパの壁に張り付いてしばらくそのままになってまた弾みで液のなかにもどったりすることがある。そうするとムラの原因になる。直線的な境界があるムラやシェーカーの動き方向のムラだとその可能性大。液量多くして、タッパ大きいの使ってシェーカー勢い良く振りすぎないようにして静かめにして時々見ながらやってみたらたぶんきれいになる。ECLのところが難しいとか言う話時々聞くけど、昔からあんまり気にしてないで適当にやってる。ECLのラップに液たらしてそれに膜のせてみたくやってて結構パッパッ適当にやってるけど抗体がちゃんとしているならばBGはすごいきれい。抗体がダメなときは何やっても徒労というかんじする。

遅くなりましたが 削除/引用 No.1176-8 - 2008/07/18 (金) 19:34:10 - ふぁご GEのテクニカルサポート部に聞いてみました。 検索などで通りすがる方にも参考になると思うので、全文載せておきます。 （以下引用） 平素より弊社製品をご愛顧頂き、誠にありがとうございます。 お問合せ頂きましたECL Advanceについて回答させて頂きます。 弊社で行う際には、メンブレンの角をキムワイプにつけて検出試薬の除いておりますが、パラフィルムやサランラップの新しい面に、メンブレンの検出面を下にして何度か置いて頂くと、メンブレンを傷つけず余分な溶液を効率よく除くことが出来ます。 また、ノイズが上がる原因の１つとして、原田様がおっしゃるように抗体濃度が高い可能性がございます。 二次抗体の大まかな希釈率の目安は、ECLで使用した濃度を1倍とした場合、ECL Plusで2.5倍希釈程度、ECL Advanceで20倍希釈程度です。 例えば、ECL（10,000倍希釈）→ECL Plus（25,000倍希釈）→ECL Advance（200,000倍希釈）のようになります。 一次抗体を節約したい場合には、一次抗体の希釈率を上げ、二次抗体の希釈率を抑えますが、検出限界を上げるという観点では、二次抗体の希釈率を上げた状態（上記を目安にして）で一定にして、目的バンドの検出程度を確認しながら一次抗体の希釈率をご検討された方が設定しやすいです。 （二次抗体には最終的に検出されるHRPが結合しているため、二次抗体濃度が高いとメンブレン全体のノイズが上がる傾向があります。 そのため、二次抗体濃度を低く抑えた状態で一次抗体濃度を検討する方が、一般的に検討が簡単に行えるためです）。 ご不明な点がございましたら、ご連絡頂けますよう宜しくお願い致します。 今後ともＧＥヘルスケアバイオサイエンスを宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1176-7 - 2008/05/21 (水) 09:39:39 - AP ＞したがって、ブロッティングがうまくいっていないのではないかと 思います。 たしかに。その可能性もありますね。 ブロットの方法、バッファー、メンブレンの種類など情報を追加して、 意見を求めては。

(無題) 削除/引用 No.1176-6 - 2008/05/21 (水) 09:32:10 - AP >私はラップの上に検出液をメンブレンの大きさ程度にスポットし、メンブレンを空気が入らないように端から検出液の上に乗せています。 その、「端から」というのが上端からではありませんか。 最初に液に触れた部分が、反応が進みやすいということはあります。 フィルムや写真の現像でもそうですが、反応液につけるのにどうしても時間差ができ濃淡がついてしまうので、速やかに連続的に（不連続な濃淡がつくと目立つので）全体が浸るようにしなければなりません。 メンブレンの場合は、単に時間差というだけではなく、最初に触れた部分の方が、急激に反応液を吸収、吸着してしまって、あとで均しても完全には濃度差が解消できないようです。この傾向は、検出液もそうですが、ハイブリ液や抗体液につけるときは特に顕著です。 ひょっとすると、抗体液のあてかたの問題かもしれません。どうやっていますか。

(無題) 削除/引用 No.1176-5 - 2008/05/21 (水) 09:14:18 - 小児科医師（ゆとり教育） いつも上方だけ検出されて下方だけ検出されないのであれば、検出液の 問題ではないのではないかと思います。検出液の問題であれば、上方が 検出されず、下方が検出されるというケースもあるのではないでしょうか。 したがって、ブロッティングがうまくいっていないのではないかと 思います。具体的には、ブロッティングの時間が長すぎることが考え られます。セパレイティングと同様に、ブロッティングも分子量依存的に 移動が起こります。ブロッティングの時間が長すぎると分子量の小さい 物質はメンブレンを通り抜けてしまうのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1176-4 - 2008/05/21 (水) 01:55:19 - あべちゃん Advance付属説明書には、membraneをフィルム上に静置して、その上からECL液を載せるように書いてあります。 今回の問題解決になるかは分かりませんが・・・ あと、私は、メンブレンをキムワイプのヘリなどでよく水切りをしています。 （ただし、メンブレンを完全に乾かせてしまうと、小さいゴミのようなスポットが出てしまいます。）

それなら 削除/引用 No.1176-3 - 2008/05/21 (水) 01:27:53 - cbb ラップより、少し堅めのフィルム使うといいですよ。 ECLの液もけちけちできます。 100円ショップで売ってるんですが。。。。 クリアフォルダーの安っぽいヤツ。 名刺入れのリフィルとか。

(無題) 削除/引用 No.1176-2 - 2008/05/21 (水) 01:10:53 - ami ハイブリバッグ使ってます。

ECL Advanceの検出失敗 削除/引用 No.1176-1 - 2008/05/21 (水) 01:07:45 - かりん ECL Advanceでウェスタンブロッティングをしています。 ECL用のフィルムに露光させています。 しかし毎回検出にムラが生じてしまいます。 メンブレンの上方は濃くバンドが出てバックも黒っぽくなりますが、下方は全くバンドが検出されず、バックもなくフィルムが透明のままです。 検出液とメンブレンの接触がメンブレン全体で均一になっていないためこのようなことが起こるのではないかと思っています。 みなさんは検出液とメンブレンをどのように接触させていますか？ 私はラップの上に検出液をメンブレンの大きさ程度にスポットし、メンブレンを空気が入らないように端から検出液の上に乗せています。５分後に周りの余分な検出液をふき取り、メンブレンをラップに包んで使用しています。

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