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(無題) 削除/引用 No.1174-9 - 2008/05/21 (水) 00:49:52 - コロン みなさん、解答ありがとうございます。 原因はおそらく、コロニーの取りすぎによる培地成分などの不純物の混入と考えられます。 りょうさま、Pumpkinさまのおっしゃる通り、もう一度調べ直し、量と採取について考え直したいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1174-8 - 2008/05/21 (水) 00:33:26 - Pumpkin おそらく竹串ではだめということはないですし、爪楊枝ではいいということでもないと思います（竹串はやったことないのでなんともですが）。 爪楊枝は多くの研究室でやられるメジャーな器具？で、私も使っており、レプリカプレート作製なんかにもなくてはならない存在です。ただし、いつまでもPCR溶液につけて置くと爪楊枝が溶液を吸ってしまって反応volがすくなくなることや楊枝からポリフェノール？（木からで色）などが溶出してきます（溶出のほうはそんなに短時間で起こるとは思えませんが）。 よく学生なんかは、PCRが走らないとこまるから少し多めにとPCRチューブ中に菌塊が見えるほど入れてしまう人がいますが、不純物（DNA以外の菌体成分や培地成分）が多く持ち込まれるのでPCRに阻害的に働きます。特に確認程度だからと反応液の系を20ul以下などにすると著しく効いてきます。前の方が書かれているように希釈産物を使っての最終volは少なくても良いのですが、コロニーを直接反応液に入れる場合にはその量を良く考える必要があります。これはプラークダイレクトPCRにもあてはまります。 ニッポンジーンのコロニーPCRキットのページでは菌体持ち込み量と増幅効率について書かれた部分があるので参考にされると良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1174-7 - 2008/05/21 (水) 00:31:39 - りょう あなたの突っつき方と、人が書き込む突っつき方と同じにはならないでしょうから、あなたが採取したサンプルの希釈系列を作ってどのくらいtemplateに使用すれば綺麗にPCRがかかるか調べた方が良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.1174-6 - 2008/05/21 (水) 00:29:44 - A あべちゃんさん > P200チップの先端にコロニーを接触させます。（この時、寒天プレートに達するまでズボッ、とは指さず、先端が触れる程度で十分） > > 20uLの滅菌水にコロニーを懸濁する。 > > この懸濁液をPCR全量の１０分の１使う。 > PCRのtotal volumeは、いつも20uLにしています。もっと少なくても良いという方もいます。 私はあべちゃんさんの様にコロニーを拾って100uLの滅菌水に懸濁して テンプレートとして1uLを使用してます。PCRの総量は25uLです。 これで問題が起きたことはないほぼありません。

(無題) 削除/引用 No.1174-5 - 2008/05/21 (水) 00:25:46 - コロン 解答ありがとうございます。 あべちゃんさま、 ＞コロニーダイレクトPCRでコロニーを多く取ると、その後のPCRが上手くいきません。 なので、コロニーを取りすぎないように、人それぞれで自分ルールのようなものがあるようです。 とありますが、とりすぎるとなぜ、PCRがうまくいかないのでしょうか？ 原因がありましたら、教えてください。 よろしくお願い致します。

多すぎるとだめです 削除/引用 No.1174-4 - 2008/05/21 (水) 00:18:39 - あべちゃん コロニーダイレクトPCRでコロニーを多く取ると、その後のPCRが上手くいきません。 なので、コロニーを取りすぎないように、人それぞれで自分ルールのようなものがあるようです。 例えば、私の場合、 P200チップの先端にコロニーを接触させます。（この時、寒天プレートに達するまでズボッ、とは指さず、先端が触れる程度で十分） 20uLの滅菌水にコロニーを懸濁する。 この懸濁液をPCR全量の１０分の１使う。 PCRのtotal volumeは、いつも20uLにしています。もっと少なくても良いという方もいます。 こんな感じです。

(無題) 削除/引用 No.1174-3 - 2008/05/20 (火) 23:20:30 - ~ 爪楊枝でコロニーをピックすると、コロニーPCRが阻害されるという書き込みを以前ネットで見たことがあります。 （たしか、TOYOBOのKadokami YoichiさんのHPだったような気が…）

(無題) 削除/引用 No.1174-2 - 2008/05/20 (火) 22:45:41 - ami テンプレートもDNAじゃないものも増えます。 テンプレートが多すぎるとあれですし、混じり物が多くてもあれです。テンプレートはちょっとだけあればいいです。 ちょっとだけつつけばいいです。

竹串でｺﾛﾆｰピックアップ 削除/引用 No.1174-1 - 2008/05/20 (火) 21:10:10 - コロン PCRを行う際に、コロニーから竹串でピックアップをしました。 その後の電気泳動での結果がうまく出ませんでした。 PCR前までの操作は上手くいっていたようなので、竹串でのコロニーピックアップに問題があると思います。 もし竹串でコロニーをとりすぎた場合、PCRにはどのような影響が出ると考えられますでしょうか？ コロニーだけでなく培地も含んでピックアップしてしまっているのでしょうか？ ご教授お願い致します。

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