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(無題) 削除/引用 No.1171-6 - 2008/05/21 (水) 00:48:14 - あべちゃん 本題から逸れますが、私はコロピー派です。 ４−８クローンほどコロニーPCRを掛けながら、PCR産物を挿入した場合は、LBプレート上でsingle colony isolationも同時にやります。 本題に戻ると、 single colony isolationを面倒ながら常にやって思うのですが、シングルコロニーと思っていても、均一でない集団が含まれています。 ２０回に１度くらいの頻度で、シングルコロニーのはずが、全く別物だったということがあります。 なので、目的断片が大腸菌ホストの中で、何らかの悪さをする場合、プレート上では、その影響がさほど大きくなかったものが、液体培地で培養してプラスミドを取ると、僅かに含まれていたネガティブクローンが増えてしまうような時、コロニーPCRと結果が異なるという現象が起こりうると思います。 うう〜んさんが ＜インサートが入っていないものは、PCR後の泳動結果のバンドの濃さが入っているものに比べて、極端に薄いこと以外は変な点は見当たりません。 と記述されていますが、バンドが薄いのは、コロニーPCRの段階で既に、目的プラスミド以外のプラスミドを含んだ大腸菌が多く含まれているのではないでしょうか？ ただ、 ＜同じ研究室の人にも起こるようになってきました。 というところがなぜなのかさっぱり分かりません。文面から、以前は上手くいっていた人も、最近、同じ問題が起き始めたと言うことですよね。 この件に関しては、例えば研究室単位で共用の自作コンピに、薬剤耐性プラスミドがコンタミしていた、くらいしか思いつきません。 でも、この場合、ネガコンを取れば分かりますよね。

(無題) 削除/引用 No.1171-5 - 2008/05/20 (火) 22:24:24 - AP 実はわたしも、colony PCRってあんまりやりません。 培養してプラスミドをとってスクリーニングします。 歩止まりの良さそうなクローニングなら、6コロニーくらい拾って いきなりAlkai/SDS, 塩析、EtOH pptで精製して、制限酵素消化、電気泳動でチェック、OKだったやつ残し、必要があれば、Phenol/CIAA抽出、PEG pptあるいは、カラムにかけてさらに精製して使います。 PCRでチェックしてから培養を始めてプラスミド精製だと、かえって二度手間、よけいな時間がかかるくらいです。 歩止まりが悪そうだとかで、多検体をチェックする必要のあるときは、 48コロニーとか96コロニーくらい拾い、Eppen. tubeに0.5 mL程度の培地に接種しキャップをして振盪培養、それをそのままbioling methodに持って行って、one tubeでプラスミドをとってチェックします。 9時5時ではちょっと無理ですが、朝一番に培養を仕掛けて、夕方くらいから精製を始めると、その日のうちにチェックするところまでいきます。 この場合は、収量も純度も不十分なので、あたりのクローンを選んで培養、精製し直します。 まあ、最近ではプラスミド精製はキットを使ってしか、やったことがない人、やらないラボなんかもあって、スクリーニングにキットを使うなんてもったいないという発想からコロニーPCRで、と思っているのかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.1171-4 - 2008/05/20 (火) 21:29:22 - おお こういうことが起こる可能性があるのでコロニーPCRはあまり意味がないと、こういう話題で躍起なってやめさせようとしてます(笑)。 実験によりますが、インサートを確認するのにコロニーPCRは2度でまになる事が多いので、大腸菌を増やして直接ミニプレップで調べることが多いです。ライゲーション、コンピテントなどプロセスがしっかりワークしていればブラントでも50%コヘッシブな末端なら90%ぐらい入ることも可也ありますから。 で、みなさんが指摘しているように両方のプライマーがインサート内に設定してある時、薄い濃度ですが、インサートDNAがプレート中に塗ってあるわけですから、そのようなバックグランドを拾ったのだと思います。 じゃあ片側インサート他方をプラスミドとか、両方プラスミドでプライマーを設定した場合質問のような事が起こるかどうかというと、起こり得ると思います。 理由の一つは、インサートの入ったプラスミドが不安定でしばしインサートがデリーションを起こしたりして抜け落ちる時。抜け落ちるとPCRはかからないのですが、コロニーはもともとインサートの入ったプラスミドを持ってたわけですし、それで抜け落ちたプラスミドをもつ大腸菌のポピュレーションが徐々に増えていくなら、弱いシグナルが出てもおかしくはないですよね。特にccdBのような毒性を示す遺伝子が載っているとそういう傾向が強いように思われます。 もう一つはたまたま大腸菌にインサートが入ったプラスミドと空のプラスミドが入り、分裂にともないどちらかが落ちていった結果、インサートが入った大腸菌がマイナーなポピュレーションになったためとも考えてます。シングルクローンは1つのプラスミドを持つ集団という概念は否定しませんが、PCRレベルではまだ完全にそうなっていないという状況だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1171-3 - 2008/05/20 (火) 16:57:36 - A もう少し詳しいプロトコール・状況を示してもらえませんか？ 例えば、 １）使っているプライマーは？（一方がインサート由来で 　　他方がベクター由来ですか？） ２）他の人たちのPCRでも予想される位置にバンドが来るのですか？ 　　それはあなたのインサートとは異なるサイズなのですか？ ３）使っている酵素のメーカー、大腸菌の種類、ベクターの種類など。 問題ない範囲でかまいませんから。

(無題) 削除/引用 No.1171-2 - 2008/05/20 (火) 16:52:14 - AP どういうプライマーですか？ クローニングサイトをはさんだベクター配列のプライマーですか。 もし、インサート配列のプライマーなら、プレート上に菌と一緒にスプレッドされたライゲーション反応液中のインサートを殖やしてしまうのですが。

大腸菌のコロニーPCRについて 削除/引用 No.1171-1 - 2008/05/20 (火) 16:23:42 - うう〜ん いつも、様々なトピックを拝見させていただき、日々、勉強させていただいています。 私の研究室では、インサート遺伝子とベクターをライゲーションさせた後、大腸菌に形質転換させ、インサート確認を大腸菌のコロニーを用いて直接行っています。しかしながら、最近、目的の位置にバンドが確認できるのですが、プラスミド抽出を行い、シーケンスをするとインサートが入っていないということがよくあります。これは、大腸菌の内在の何かを拾っているのかとあまり気にしていなかったのですが、同じ研究室の人にも起こるようになってきました。自分なりに色々振り返ってみたのですが、インサートが入っていないものは、PCR後の泳動結果のバンドの濃さが入っているものに比べて、極端に薄いこと以外は変な点は見当たりません。なぜ、このようなことが起こるのかがわかりません。 同じような境遇にあった方などのご教授をいただけるとありがたいです。よろしくお願いします。

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