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(無題) 削除/引用 No.1170-5 - 2008/05/23 (金) 16:25:44 - おお > > > DNAが濃すぎて、ウェルの中に入らないと、似たような結果になることがあります。 > > 薄めて流してみてはいかがでしょうか？ > > そうなんですか！！知らなかったです。 > 薄めてやってみます。 > 多分正しく理解されていると思いますが、テンプレートがおおくてそれを見ている可能せいがあるということです。あとは非常に高分子のノンスペのバンドが出てるかもしれませんね。それともリボソーマルRNAが引っ掛ってるかな。 テンプレートは電気えいどうで検出出来るほど入っていると入れ過ぎの可能性があります。反応チューブに1-10ngぐらいでいいと思います。あと、精製のとき、RNAseA処理しているでしょうか?場合によっては邪魔になるかもしれませんし、DNA量の見積が正確ではなくなります。条件はそんなにあれこれいじるとはまっちゃいますので、あにいリング温度を上げるのとさげるのぐらいはやっても良いかと思います。目的のバンドより小さいプロダクトができている場合は伸長反応を長くすると解決する場合があります(100bpsあたりにスメアーがあるようですし)。あとはプライマーを変えるかなぁ?

(無題) 削除/引用 No.1170-4 - 2008/05/20 (火) 17:19:49 - ~ >本当にたまにバンドが出ることがあって たまに出た時のサンプルでは、再現性はあるのでしょうか？ 同じサンプルでは、いつでもバンドがでるのでしたら、 DNA精製に問題があると思います。 同じサンプルでもでたりでなかったりするのであれば、 PCRに問題があると思います。(サンプルがかかる、かからないかのぎりぎりの状態かもしれませんが) >抽出はproKを使用し、 >その後フェノールークロロホルム抽出→エタ沈をしています その系は、ラボで確立されているものでしょうか？ そうであれば、他の人が抽出したDNAを使ってみることはできませんか？ また、収量や分解の具合は確認されていますか？

お世話になります。 削除/引用 No.1170-3 - 2008/05/20 (火) 16:05:50 - 毎日が苦行 早速のレスありがとうございます > ポジコンも包埋切片から抽出しているDNAなのでしょうか？ > そうでなければ、DNA抽出に問題があって増えていないのかもしれません。 ポジコンは包埋切片からではないものなので、 ＤＮＡの抽出方法がおかしいのではと思っても見たのですが、 本当にたまにバンドが出ることがあって 取れていることは取れているんだと結論付けてしまいました。 抽出はproKを使用し、 その後フェノールークロロホルム抽出→エタ沈をしています。 > DNAが濃すぎて、ウェルの中に入らないと、似たような結果になることがあります。 > 薄めて流してみてはいかがでしょうか？ そうなんですか！！知らなかったです。 薄めてやってみます。 > 100bp以下のスメアは、プライマーダイマーなどの非特異な増幅だと思います。 ネガコンに、ちょうど出したい117ｂｐ付近からスメアが出るので 結果としてすごく説得力がないような気がしてしまって・・・ お聞きしました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1170-2 - 2008/05/20 (火) 15:39:37 - ~ ゲノミックPCRで、117bpをとってこようとしているのですね。 ポジコンも包埋切片から抽出しているDNAなのでしょうか？ そうでなければ、DNA抽出に問題があって増えていないのかもしれません。 ポジコン、ネガコン以外のサンプルでは、 たまにうまくいっているのですか、 それとも全てうまくいっていないのですか？ >エチブロで染色される物質が下に流れていかずに、たまっているんです。 DNAが濃すぎて、ウェルの中に入らないと、似たような結果になることがあります。 薄めて流してみてはいかがでしょうか？ 100bp以下のスメアは、プライマーダイマーなどの非特異な増幅だと思います。

アクリルアミドでのＰＣＲ 削除/引用 No.1170-1 - 2008/05/20 (火) 15:14:16 - 毎日が苦行 パラフィン包埋切片からＤＮＡを抽出しＰＣＲをかけて、 117ｂｐの産物を引っ掛けたいんですが、思うようにバンドがでません。 ポジコンは出るんですが。 ゲルはアクリルアミドを使用しているのですが、 気になるのがレーンのくぼみの部分に エチブロで染色される物質が下に流れていかずに、たまっているんです。 旨くバンドが出たポジコンのレーンにはそのような現象は認めません。 バンドが出ないことに何か関係はあるのでしょうか？ また、ネガコンもおかしくて、100ｂｐ付近から下にスメアがでます。 これは旨くバンドが出なかったサンプルでも同様の現象がおきます。 プライマーダイマーなんでしょうか？ サイクル数は35で、すごく多いわけではないんですけど。 この4月に実験を始めたばかりの初心者です。 助けていただければ助かります。 よろしくお願いします。

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