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(無題) 削除/引用 No.1169-5 - 2008/05/20 (火) 15:30:10 - AP H2O2/Methnolの処理が怪しいように思います。 同じ処理したのを蛍光抗体法で検出してみれば検証できると思います。 パラフィン切片で、抗原不活化のための加熱をしても、内在性のPOは生きているのでしょうか。一度、チェックしてみて、必要なければH2O2/Methnol処理は省いたほうがいいのではないでしょうか。 Methanolに感受性の抗原もあります（この場合他の部分は染まっているので関係ないでしょうが）。EtOHに変えるとよい場合があります。 内在性のPOはNaN3で失活させるてもあります。 whole mountだと、DABの染めムラはよくあることなんですが（表層で基質を猛烈に消費してしまって内部が染まりにくい）、おまじないで、基質液を薄くしてゆっくり反応させるとか、先にDABだけでインキュベートして、十分染み渡ってからH2O2を加えるとかします。切片だと関係なさそうですが。

(無題) 削除/引用 No.1169-4 - 2008/05/20 (火) 14:05:36 - 組織 > 蛍光染色ではきれいに周辺部分も染まります。 > 蛍光染色にはない、POの不活性化と最後のDAB処理が関係してそうに思えます。 蛍光染色の部分を見逃してました。仰るとおりHRP-DAB系の問題でしょうね。 抗原によってはH2O2処理で失活するものがあって、こういう時はH2O2処理をなくすか、一次抗体洗浄後に入れてやれば染まることがあります。 CD抗原ではよくありますね。

(無題) 削除/引用 No.1169-3 - 2008/05/20 (火) 13:55:16 - Naturer 組織さん 返答ありがとうございました。 指摘していただいた点が一番考えられたので、注意して行いましたが同じ結果でした。 バックも全く出ないので、抗原の分布による差ではないと思います。 蛍光染色ではきれいに周辺部分も染まります。 蛍光染色にはない、POの不活性化と最後のDAB処理が関係してそうに思えます。

(無題) 削除/引用 No.1169-2 - 2008/05/20 (火) 13:35:43 - 組織 抗体をのせる前に切片上にPBSなどが残っていると、その部分の抗体濃度が低くなり、染まりむらができる（シグナルが弱くなる）ことがあります。 対策としては、試薬をのせる前に、切片上の液をできるだけ除く。 試薬をドロップした後は、スライドグラスを手で傾けるか、ピペットチップなどを使って、切片上の試薬をよく混ぜる。 この点を確認してください。 あと根本的なことですが、その抗体は脳全体が染まるべきものですか？ 染色むらではなくて、大脳皮質はネガティブになるとか、そういう報告はありませんか。 念のため確認してください。

DAB染色でムラ 削除/引用 No.1169-1 - 2008/05/20 (火) 13:04:52 - Naturer マウス脳のDAB染色でムラが出ます。 脳周辺部分で全く（バックも）染色されません。 条件は パラフィン包埋 クエン酸バッファーで賦活化（オートクレーブ） 0.3%H2O2-MeOH, 15min 10%正常ヤギ血清でブロッキング, 30min 1st Ab in 0.1% Triton, overnight 2nd Ab~ ニチレイヒストファイン SAB-PO Multi DAB 0.004% 蛍光染色ではムラが出ないので、ペルオキシダーゼの不活性化がくさいと思っています。 なおすべての行程でムラが出ないよう、よく溶液を混ぜています。 よろしくお願いします。

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