全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1168-10 - 2008/05/22 (木) 05:19:40 - Jackie >DT40です。B細胞由来由来です。 DT40は効率が高いみたいですね。 どうしてこの細胞は効率が高いのでしょうか。 Webで調べると、理由はまだわかっていないようですね。 ただ、DT40はB細胞由来なので、リコンビーネーションの活性が高いのが、理由かもしれませんね。実際に、ヒストンのアセチル化阻害剤であるトリコスタチンAを作用させるとDNAの組換えが加速して、個々の細胞がさまざまな抗体を産生するという報告もあります。 http://www.kyoto-u.ac.jp/notice/05_news/documents/070310_11.htm によると、 外来遺伝子がターゲット挿入される割合は、 酵母：50−100% DT40:10−80% 動・植物細胞：<0.1% とあります。

(無題) 削除/引用 No.1168-9 - 2008/05/21 (水) 17:41:33 - Ｔ ちなみに、最初の論文の 14% という数値そのものはあまり参考にはなりません。というのは、この時のターゲッティングベクターには neo マーカーも乗っていないので、通常のノックアウトで行うように実際に G418 耐性コロニーをスクリーニングして出した数字ではないからです。 （１）ES 細胞にターゲッティングベクターをエレポすると、10^6 個に 1.4 個の割合で HPRT 遺伝子座で相同組み換えが起きて HAT 耐性のコロニーが出た。 （２）同じ条件で pSV2Neo をエレポすると、10^5 個に１個の割合で G418 耐性コロニーが出た。 という実験結果から算出した、あくまで計算上の数字です。当然、数倍程度の誤差はあり得ます。ただ、２桁も３桁も違うということは考えにくいでしょう。 negative selection による陽性クローンの濃縮効果はおよそ数倍から１０倍と言われています。例えば、DT-A を用いた最初の報告では約１０倍効率が上昇したと報告されています。 Homologous recombination at c-fyn locus of mouse embryonic stem cells with use of diphtheria toxin A-fragment gene in negative selection Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 9918-9922 (1990)

(無題) 削除/引用 No.1168-8 - 2008/05/21 (水) 16:59:21 - ats Tさん、ご訂正ありがとうございます。皆様にお詫びします。 やはり効率はターゲット遺伝子領域およびコンストラクト配列によるのですね。私の唯一の経験では、下手だったせいもあって相同領域を6kb,3kb、DTカセット有りにしましたが効率は5%ほどでした。

(無題) 削除/引用 No.1168-7 - 2008/05/21 (水) 14:30:34 - おお >[Re:1] Jackieさんは書きました : > 、ニワトリの株細胞でも、ノックアウト効率の高い細胞があるようです。 > DT40です。B細胞由来由来です。 あ、これは質問のないようではありませんでしたね

(無題) 削除/引用 No.1168-6 - 2008/05/21 (水) 10:11:37 - Jackie atsさん、ＥＳさん、Ｔさん、ありがとうございました。 普通の細胞でも可能なのですね。 以前ノックアウトマウスを作成したときには、確か、G418耐性コロニー中、5%くらいが本物であった記憶があります。このときはDTAを使いました。 もし目的の遺伝子がES細胞で発現している場合は、Neoをノックインして目的の遺伝子のプロモーター制御下に置くようにすると、G418耐性コロニー中、50%くらい陽性細胞をいうこともあるそうです。 現在、プライマリー細胞を使って、LacZやGFPをある遺伝子にノックインしたいと考えていますので、とりあえず、1コピーの相同組み換えでもＯＫです。 In vitroで両方の対立遺伝子をつぶす方法として、ネオカセットが入っている場合、G418の濃度をあげていくと、対立遺伝子の相同組み換えを起こすことにより耐性を獲得した細胞が出てくるそうです。。 また、PuroとかHygroで、対立遺伝子をつぶすこともできると聞いています。ですので、もしES以外でも、普通にできるのであれば、試してみたいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.1168-5 - 2008/05/20 (火) 18:04:31 - Ｔ > オリジナルの論文 "Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells" Nature 330, 576 - 578 (1987) によれば、G418 耐性クローンの１４％が相同組換体になっていた計算です。 1.4×10^-6 等の数値は、エレポに用いた細胞数に対する相同組換体の割合ですね。 もちろん negative selection など使っていない単純なベクターです。

(無題) 削除/引用 No.1168-4 - 2008/05/20 (火) 17:20:44 - ats ESさん 効率良いですね、相同領域を長めにしているのでしょうか？ ちなみに5'arm,3'armは何kbほどですか。その場合、PCRでのスクリーングは可能ですか？ 宜しければ、後学のために教えていただけませんか。

(無題) 削除/引用 No.1168-3 - 2008/05/20 (火) 16:30:33 - ES うちではESでnegative selectionをしていませんが、数百クローンに一つは相同組換えされていますよ。

(無題) 削除/引用 No.1168-2 - 2008/05/20 (火) 15:34:33 - ats あえて、詳しく書きませんが、 まず、 通常の細胞と同じく、ES細胞の相同組み換え率はとても低いのです。 ３の答えの一つ：ベクター構成に工夫してNegative Selectionができるようにしてあるからです。 Negative Selection法が報告される前は得られた薬剤耐性クローンの1/10000-1/100000だったらしいです。オリジナルの論文を読んでみてください。 Negative Selection法を使っても得られた薬剤耐性クローンの数%が普通の確率です。 > １．マウスでＥＳ細胞以外でも、相同組み換えによる遺伝子ノックアウトは可能でしょうか？ 可能です。論文もいくつか報告されています。正常二倍体でも二カ所ノックアウトしないといけないので面倒です。染色体が異数体化している（癌）細胞は無理。ES細胞は片側アレルのみノックアウトできれば良い。これが、３の答え（？）の二つ目。

ＥＳ細胞はなぜ相同組換えの効率が高いのでしょうか 削除/引用 No.1168-1 - 2008/05/20 (火) 12:52:15 - Jackie 相同組み換えを利用した遺伝子破壊は、哺乳動物では、ほとんどＥＳ細胞を使った実験だと思います。もちろん、効率のほかに、その先には、遺伝子ノックアウトマウスの作成という目的があるからでしょう。確か、ＥＳ以外に、生殖系列の幹細胞も可能だったと思います。また、ニワトリの株細胞でも、ノックアウト効率の高い細胞があるようです。 質問は、 １．マウスでＥＳ細胞以外でも、たとえば、線維芽細胞などで、相同組み換えによる遺伝子ノックアウトは可能でしょうか？ ２．もし可能ならば、その場合は、効率は非常に低いのでしょうか？ ３．なぜＥＳ細胞だけが効率よくノックアウトできるのでしょうか？ よろしくお願いします。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---