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(無題) 削除/引用 No.1167-13 - 2008/05/21 (水) 14:11:00 - おお >[Re:10] おおさんは書きました : > ELISAについてはあなたの目的のタンパクに対する抗体は、あなたの持っているモノクロだけでですか?あなたの抗体をELISAプレートに張り付けて物をトラップして違う抗体で検出するサンドイッチでやればいいかとも思いました。サンプルにIgG(あるいはノンスペのタンパク)がどの程度競合するかにもよると思います。 あ、このアイデアはダメですね。。。。お恥ずかしい、、、、

(無題) 削除/引用 No.1167-12 - 2008/05/20 (火) 22:48:56 - ami 25kDaあたりのものは、本当にIg軽鎖ですか？というのは少し気になる。

(無題) 削除/引用 No.1167-11 - 2008/05/20 (火) 20:43:13 - おお あとウエスタンについては、目的のバンドを強く出すために抗体の濃度を上げてもいいかと思います。ノンスペのバンドは強く出ようが、サイズが離れてて邪魔をしなければと言う考えです。 ん、あと血清は生物種は何でしょうか?生物種が違えば反応しない可能性はないでしょうか?それがあなたの実験の助けになるかは実験によると思いますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1167-10 - 2008/05/20 (火) 20:31:19 - おお わたしもモノクロの一次抗体がクロスしているなら精製はあまり改善の役に立たないだろう名と思います。それと2次抗体をかえても(非変性IgGだけを認識するやつは別ですが)を牛で吸収したものをつかっても、結果が改善するとは思えませんね。すでにそういう2次抗体でやっているようですし。 25kDaのそのバンドはIgGとクロスしていると考える理由は何でしょうか?目的のタンパクのアイソフォームあるいはIgG以外のものという想定もしておかなくてはという気もします。 ELISAについてはあなたの目的のタンパクに対する抗体は、あなたの持っているモノクロだけでですか?あなたの抗体をELISAプレートに張り付けて物をトラップして違う抗体で検出するサンドイッチでやればいいかとも思いました。サンプルにIgG(あるいはノンスペのタンパク)がどの程度競合するかにもよると思います。

(無題) 削除/引用 No.1167-9 - 2008/05/20 (火) 15:44:26 - AP 一次抗体がクロスしているのですか。それでは二次抗体を変えてもだめということですね。また、ものがモノクロだけに、一次抗体を精製してクロスを抑えようとしてもだめでしょう。 サンプルの方を工夫して、よけいなものが入らないようにしておくしかなさそう。 本当に軽鎖がターゲットになっているなら、他の方が書かれているように、Igを除く処理をすればよいでしょう。 あるいは、ゲルろ過、イオン交換カラム、硫安沈殿などで分画して、目的のタンパク質が含まれ、交差するタンパク質が入らないようなサンプル調製プロトコールを完成するとか。

(無題) 削除/引用 No.1167-8 - 2008/05/20 (火) 14:46:30 - ＳＳ 説明不足で申し訳ありませんでした。 ブロッキングした転写膜に一次抗体をスキップして二次抗体を反応させたところ、25kDaにはバンドは検出できませんでしたので（他にもバンドはありませんでした）、おそらく一次抗体がサンプル中のIgGを認識していると考えられます。また、HRP標識してあるのは二次抗体であります。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1167-7 - 2008/05/20 (火) 14:24:47 - おお ちょっと確認したいのですが、あなたの目的のタンパクに対する抗体がIgGを認識しているのか、2次抗体が直接血清中のIgGを認識しているのかはチェックされているのでしょうか。たとえば、ブロッティングのあとブロッキングし、１次抗体をスキップして2次抗体を使うと25kDaのそのバンドが出ますか? それともあなたの抗体は直接HRPとかAPでラベルされているのでしょうか? この結果次第で、対処の仕方、ELISAのアプローチの仕方も変わってくるのでは無いでしょうか。

皆様どうもありがとうございました 削除/引用 No.1167-6 - 2008/05/20 (火) 13:51:54 - ＳＳ サンプルの前処理法と抗体の処理および二次抗体のセレクトを教えて頂き誠にありがとうございました。是非とも試してみたいとおもいます。 ＞目的のタンパク質に対するアフィニティーがあがります。 ですが、普通、目的タンパク質のバンドも検出されると思うのですが。 目的タンパク質も25 kDa程度なのですか？ 目的バンドは違う分子量なので一応うっすらと確認できましたが、25kDaのバンドとは比べものになりませんでした。 実は、この抗体（モノクロ）、自作でありまして以降の実験でELISAに持ち込もうと考えておりました。この抗体では、ELISAの系でもWB同様にサンプル中のIgGを捕捉してしまい目的タンパク質の定量はできないことになってしまいますよね？？　お教え頂いたようにあらかじめ血清サンプルをIgGトラップする、抗体を精製し直す以外、他にELISAで系をうまく確立する方法は考えられるでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.1167-5 - 2008/05/20 (火) 12:17:17 - おお protein A/Gビーズなどを通してIgGをトラップする。 ウシIgGで吸収された(メーカーによっては吸収されていても、認識してしまうものがあるので信頼できるやつ)2次抗体をつかう。 このようなコンビネーションでしょうか。 あるいは、あなたのターゲットに対する抗体を、コバレントにゲルにクロスリンクして、IPした後に溶出しウエスタンする。

(無題) 削除/引用 No.1167-4 - 2008/05/20 (火) 11:55:07 - AP IPによく使われる、未変性Igのみを認識する二次抗体をつかうといいのではないでしょうか。 たとえば http://www.baybio.co.jp/japanese/product/etc/etc01.html

(無題) 削除/引用 No.1167-3 - 2008/05/20 (火) 11:24:10 - L Igの軽鎖を精製して、アフィニティー精製すると、軽鎖認識抗体は抗体液から取り除かれますから、 目的のタンパク質に対するアフィニティーがあがります。 ですが、普通、目的タンパク質のバンドも検出されると思うのですが。 目的タンパク質も25 kDa程度なのですか？

(無題) 削除/引用 No.1167-2 - 2008/05/20 (火) 11:08:20 - さとし 実験目的によりますが ・違う抗体を試す ・違う電気泳動を行う ・除去キットを使う ぐらいが次の選択肢では？

血清サンプルのＷＢ 削除/引用 No.1167-1 - 2008/05/20 (火) 10:59:32 - ＳＳ 血清サンプルを電気泳動し、WBした場合、どうやら血清中のimmunogloburin軽鎖を検出しているようで（25kDaあたり）目的タンパク質を検出できません。このような場合どうしたらよいでしょうか？？

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