全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

SDS-IPのやり方。 削除/引用 No.1165-5 - 2008/05/21 (水) 20:50:20 - 名無し そういうIPはたまにやります。自己流ですがやり方を書きます。昔、適当に論文や本を読んで適当にやってたら上手くいったことがあったのでそれからはこうやってます。 0.1~0.3mlくらいの1%SDSの入った適当なbufferで細胞をとかす（非イオン性界面活性剤や還元剤は入れない）。粘性なくなるまでソニケーションしてDNAを切る。遠心して不溶物除く。上清をとり、これを、その10~20倍容量の1%NP-40または1%Triton X-100の入ったbufferで希釈（還元剤はなし。本とかみると、SDSの濃度がNP-40やTX100の1/10かそれ以下になるのが大切らしい）。遠心して不溶物除く。上清をとり、抗体液入れる。室温or 4Cで30分ないし１時間程度くるくる回すやつで回す。protein G beadsをごく少量加える。（容器にキャパシティー書いてあるから参考にするといい。別に適当でもいいけど、出来るだけ少ない方が方がいいとおもう。）室温 or 4Cで1時間程度くるくる回す。遠心する。ビーズを希釈に使ったのとおなじbufferに懸濁して遠心で２〜３回くらい洗う。上清をできるだけ完全に除く。液全量がゲルのウェルに収まることを考慮してごく少量のSDS-sample buffer（bME+)に懸濁。加熱する。電気泳動する。ウェスタンする。 細かいところはケースバイケースなので、現状に応じて適当に改変して下さい。protease inhibitorなどは入れた方がいいと思います。O/Nのインキュベーションはしないほうがいいです。いままでの経験では、上手くいく抗体はかなりいい加減なことやっても再現性よくちゃんと取れてきます。使えない抗体はどんなに慎重にやってもいろいろ工夫しても全くダメです。IPできると書いていないのは多くの場合not testedという意味と理解しています。またIPできると書いてあっても実際には出来なかったものもそんな珍しくないです。

(無題) 削除/引用 No.1165-4 - 2008/05/21 (水) 16:55:25 - おお > 冷たくあしらうつもりはないのですが、やって見たら!ぐらいしかいえないですね。ゲル濾過とか、ネイティブなコンディションでえいどうするとかでコンプレックスを探っていくのが無難かなとも思います。 > あ、コンプレックスの解析じゃなくて濃縮がしたいのでしたね、、、失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.1165-3 - 2008/05/21 (水) 14:48:52 - おお >[Re:1] Masaさんは書きました : > ある蛋白を免疫沈降で分離濃縮したいのですが、ウェスタンブロット用の抗体しか市販されていません。 ウェスタンブロット用の抗体とありますが、IPに使えないのかテストしていないのでIP用としては売っていないのかが気になるところです。一度普通にIPしてみればどうかとも思います。 >そこで試料蛋白を還元剤存在下でSDS化しアセトン等で沈殿させて脱塩したのち免疫沈降できないものかと考えているのですがいかがなものでしょうか？ 冷たくあしらうつもりはないのですが、やって見たら!ぐらいしかいえないですね。ゲル濾過とか、ネイティブなコンディションでえいどうするとかでコンプレックスを探っていくのが無難かなとも思います。

(無題) 削除/引用 No.1165-2 - 2008/05/20 (火) 22:53:18 - ami WB時には、蛋白にSDSが結合しているのでしょうか。

SDS化蛋白の免疫沈降 削除/引用 No.1165-1 - 2008/05/20 (火) 04:46:23 - Masa ある蛋白を免疫沈降で分離濃縮したいのですが、ウェスタンブロット用の抗体しか市販されていません。そこで試料蛋白を還元剤存在下でSDS化しアセトン等で沈殿させて脱塩したのち免疫沈降できないものかと考えているのですがいかがなものでしょうか？

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---