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(無題) 削除/引用 No.1162-10 - 2008/08/02 (土) 10:09:14 - K Bio-Radの IPGゲルで同じような現象がおきました。 soonさんと同じく、私もチオウレアは使っていません。 メーカーに連絡し、（アメリカの）テクニカルサポートとやり取りをしたのですが、 ぼうじゅんさせるボリュームの問題だとか、添加するDTTの量が問題だとか、ありとあらゆる クレームをつけてくれました。（会社が、ということではなく担当者の問題だと思います） 全く同じ試料、同じぼうじゅんバッファーを使用しているのにそのロットのIPGでのみ問題がおきたので、ロット自体に問題があるのでは、と主張し、代品を送って貰いました。 新しいロットでは問題がおきていません。 hさんと同じ問題かどうかはわかりませんが、そういうこともあった、という一例として 書き込みます。

(無題) 削除/引用 No.1162-9 - 2008/07/15 (火) 23:38:55 - soon 自分の研究室では　BioRadのIPGゲルを用いておりますが、 白濁やゲルの盛り上がりが確認される場合があり、 似た現象が起きているので書き込ませて頂きます。 白濁は起きる場合と起きない場合があり、 解決できませんが、二次元の泳動像の再現性に 目立って影響がなさそうでしたので そのまま実験を続けています。 個人でなく研究室で　二次元を行っている人に 不特定に起きています。 marioさんの書き込みを拝見させて頂くと チオUreaを使用したときに、そのようになることがあるとのことですが 自分の研究室では　ureaだけでチオUreaを用いていません。 今度もこのトピックを参考にさせていただきます。 hさんの実験がうまく進行なさいますように　応援しております。

とおりすがりで 削除/引用 No.1162-8 - 2008/07/15 (火) 15:10:33 - mario > 1次元目終了時に、ゲルの陽極側が2cmほど白濁し、膨張するといった症状がでました。 > 経験者にも尋ねてみたのですがそういった経験はなかったようです。 > どなたかこのような経験はありませんか？ たまたま見かけましたので。 最近同様の現象が私と、もう一人の研究者に発生していましたので、GEに問い合わせたところ、チオUreaを使用したときに、そのようになることがあるとのことでした。 特にゲル全体の泳動ﾊﾟﾀｰﾝに問題はありませんし、その部分は解析に使わない部分ですので、無視しています。

(無題) 削除/引用 No.1162-7 - 2008/07/14 (月) 19:04:34 - h みなさんお返事ありがとうございます。 いろいろ忙しくてコメントするのを忘れていました。 前回は、サンプル調製がうまくできていない可能性が高かったため、 精製の際の条件検討をいたしまして、 SDS-PAGEでは複数のバンドが確認できるまでにいたりました。 そして、久々にやってみたところ、 1次元目終了時に、ゲルの陽極側が2cmほど白濁し、膨張するといった症状がでました。 経験者にも尋ねてみたのですがそういった経験はなかったようです。 どなたかこのような経験はありませんか？ まだまだ未熟にもかかわらず、他人に指導する立場になりそうです。 原因のわかる方がいらっしゃいましたらぜひご教示ください。 もう少し詳細を書いてみますと、 ゲル長13cm 膨潤時間15h程度 サンプルは乳酸菌のタンパク質です 前日に調製して冷蔵保存し、翌日から膨潤しています。 泳動プログラム V　　　　mA　　　 W　　　　時間 501530分 200153時間30分 3500157時間30分

(無題) 削除/引用 No.1162-6 - 2008/05/24 (土) 08:00:28 - momo サンプルに尿素は入ってますか？ あまり古いと劣化して再現性が取れなくなりますよ！ 当たり前のことですがそこらはどうでようか？

(無題) 削除/引用 No.1162-5 - 2008/05/21 (水) 22:12:46 - 名無し ゲルのサイズによって違うので分からないけど、50で見えなければ150とか200くらいアプライすればどうでしょうか。膨潤時にサンプルしみ込ませるやり方の方が確実にアプライできます。ウェルでアプライするやつだと（あれは難しい）載せた分の蛋白質が上手くゲルに移行していない事がよくあり、アプライしたつもりになってるだけ事があります。ヨードアセトアミドはやってもやらなくても少なくともみかけは変わらないと聞いた事があります。1次元のSDS−PAGEやるとき普通はヨードアセトアミド処理しないし、でもそれで特に困る事ないし。２次元のときだけやりなさいというのは変。平衡化時間が短いと２次元ゲルへの移行が悪くなることあった。15で２回はギリギリかちょっと短か目という感じする。 以上は数十個のスポットが出るようにそれらの蛋白質がちゃんと抽出されていることが前提。特定の蛋白質スポットは見本のゲルと同じ程度あって、でもあるものは全く見えないということだと抽出方法が適切でない可能性があります。全体に薄いというなら蛋白質定量が正しくない可能性があります。

単純に 削除/引用 No.1162-4 - 2008/05/21 (水) 01:33:32 - cbb 同一のサンプルでも凍結しただけでも、 スポットが減ることがありますよ。 もう少し情報がないとアドバイスしにくいですね。TXさん同様。

(無題) 削除/引用 No.1162-3 - 2008/05/20 (火) 16:11:40 - mms > しかもスポット強度も小さいです(サンプルは50 µg)。 もう少し感度のよい染色液を使ってみてはどうですかね？ 値段は高いですが、Sypro Rubyとか。

(無題) 削除/引用 No.1162-2 - 2008/05/20 (火) 15:52:37 - ＴＸ > 二次元電気泳動の再現性が取れません。 まず、流したサンプルは同じ抽出日のサンプルでしょうか？ 同じ抽出日のサンプルで再現性がとれないのなら、 1次元、2次元時に問題があるのでしょう。 抽出日がちがうのなら、抽出工程に問題があるのかもしれません。 > 本来ならば数十個のスポットが見えるはずなのに > 数個しか確認できません。 > しかもスポット強度も小さいです(サンプルは50 µg)。 本来ならばというのは、論文やデータベースなどで確立された実験結果が示されているのでしょうか？ もうちょっと、詳しく記述してくれれば、コメントできるかもしれません。 サンプル clean-upの有無 使用しているstrip gelの長さ 膨潤時間 1Dの泳動条件 2Dの泳動条件 1Dにおける再現性 2Dにおける沈殿の有無など > また、プロトコルによってヨードアセトアミドが入っていなかったり（タンパク質の再酸化を防ぐために必要なのだとは思いますが）、SDS平衡化bufferのpHが6.8または8.8（洋土社のタンパク質実験ノートにはヨードアセトアミドを使用する場合はpH8.8にする必要があるという記述がありました）だったりするのですが、これは何か違いがあるのでしょうか？ 私も、ここらへん詳しくないのですがGEのハンドブックによれば、ヨードアセトアミドによる平衡化は水平型2次元では必須ですが、縦型2次元ではオプションとなります。 DTTを使用する際は、PH6.8,ヨードアミドを使用する際は、PH8.8を使用します。PH8.8にするのは、ヨードアミドとDTTとの反応により生じる水素ヨウ素酸(酸性酸化物）を安定化することで、ストリーキングやアーティファクトを防止するためだそうです。 私はめんどくさいので、平衡化バッファーはPH8.8にしてDTT,ヨードアセトアミドによる平衡化をおこなっています。

二次元電気泳動の再現性 削除/引用 No.1162-1 - 2008/05/19 (月) 21:10:21 - h 二次元電気泳動の再現性が取れません。 本来ならば数十個のスポットが見えるはずなのに 数個しか確認できません。 しかもスポット強度も小さいです(サンプルは50 µg)。 等電点電気泳動にはMultiphor �U IEF System（Amersham Bioscience社）を使用し、Amersham Bioscience社のその他の試薬を使用してゲル膨潤bufferを調製しています。 SDS平衡化にはDTT含有のものとヨードアセトアミド含有のものを用いて15分ずつ平衡化しています。 二次元電気泳動は縦型のものを使用しています。 どこの操作が悪いのか良く分からず困っています。 何か二次元電気泳動について気をつけるべき点はあるのでしょうか？ また、プロトコルによってヨードアセトアミドが入っていなかったり（タンパク質の再酸化を防ぐために必要なのだとは思いますが）、SDS平衡化bufferのpHが6.8または8.8（洋土社のタンパク質実験ノートにはヨードアセトアミドを使用する場合はpH8.8にする必要があるという記述がありました）だったりするのですが、これは何か違いがあるのでしょうか？

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