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そうですね。 削除/引用 No.116-3 - 2007/08/27 (月) 16:10:26 - 6487 通りすがり さん レス有難うございます. posi conがもらえるならこのような質問はしません。 状況が状況で、自分ではどうしようもなくなってしまった中、 このサイトを見つけたので書き込みをしてみました. とりあえず、読んでくださってありがとうございました. 成功している人がいるのに このような書き込みをしてしまって申し訳ありませんでした.

(無題) 削除/引用 No.116-2 - 2007/08/27 (月) 14:46:19 - 通りすがり >他の人が同じようにやって成功している系なので、何が失敗なのかわかりませ >ん.ちなみにposi conはありません. 成功している人がいるならその人から 成功しているサンプルなどを分けてもらって ポジコンとしてやってみてください。 この掲示板で実験に間してコントロールとってない状態で 質問していて、最終的に解決してるのほとんど見たこと無いです。

actin抗体でもバンドが出ません. 削除/引用 No.116-1 - 2007/08/27 (月) 13:53:19 - 6487 ウェスタン初心者です. 非常に基本的な質問で申し訳ありません. 培養細胞から抽出した50kDaくらいの核内タンパク質のウェスタンをしていますが、actin抗体でもバンドが全く出ません。 抽出法はPBS(-)wash後、10cmシャーレにlysis buffer (NP-40, protease inhibitor cocktail, phospatase�T&�U）)を100ulかけ、on iceで5minおいてから、スクレイパーでかき取ってtubeに移し、5min x3 vortexし、95度 5min boilし、泳動します。 泳動：Tris/Glycin/SDS buffer 20mA→120V 約1時間位 転写：Tris pH8.3/glycin/MeOH(20%) ウェット式 0.2A 80min blocking:0.2%/Tween/5% skim milk/PBS(ちなみにこの組成で4℃保存して使いま　　　　　わしてます) 1次抗体：4℃ O/N (0.2%/Tween/5% skim milk/PBS) 2次抗体：r/t 1時間 (in 0.2%/Tween/5% skim milk/PBS) detect:Western Lighting plus　 手技もあるかと思いますが、思いがけない失敗などありましたら教えていただけるとヒントになるかもしれません. 他の人が同じようにやって成功している系なので、何が失敗なのかわかりません. ちなみにposi conはありません. actin抗体は新しいものです. だいたいreporobeしてからactin抗体をかけます. 宜しくお願い致します.

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