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二次抗体の失活 削除/引用 No.116-23 - 2007/09/04 (火) 11:48:03 - APHRP トピック最初の記事で 0.2%/Tween/5% skim milk/PBS(ちなみにこの組成で4℃保存して使いまわしてます というところが引っかかるのですが、二次抗体用バッファは用事調整していますか？ 古いバッファに雑菌が生えるとAP検出のバックが高くなりますし、防腐剤としてアザイドを入れたものを使うとHRPが失活しますよ。

抽出段階で･･･． 削除/引用 No.116-22 - 2007/09/04 (火) 11:04:42 - 6487 >えーっとさん 私も細胞からの抽出からやり直したいのですが、 新しい細胞をてにいれるのが非常に難しい状況にあるため、 その前にこのような現象がおこる(低分子にしかバンドもしくはバンドもどき)原因がお分かりになれば教えていただきたいのですが･･･． やっぱりタンパクが壊れてるのでしょうか． >XXXさん 私もやりました･･･． プラスマイナスの間違いと、２次抗体の間違い･･･． 今のとこ、大きなケアミスはそれくらいです(たぶん)． >トラ さん レス有難うございます． ここのラボでは、WakoのSuperSepというReady　gelを使っているので ゲルには問題ないと思います． でも、貴重な情報ありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.116-21 - 2007/09/04 (火) 09:47:53 - トラ ゲル作製用のTris bufferなどのpHは合っていますか？ WBを始めた頃同じような状況に合ったのですが、最終的にはゲル作製用Tris buffer (分離、濃縮用共に)を作り直したら上手くいきました。ちなみにpHはゲル作製時の温度に合わせて計ってみてください。 解決したので詳しく調べていないのですが、なんらかの原因でゲルは固まるのですが網目構造がおかしいのか、上手く分離されないような状況だったようです。

(無題) 削除/引用 No.116-20 - 2007/09/03 (月) 16:43:55 - えーっと 結論が見えてきましたね。 通常、細胞ライゼートをSDS-PAGE、CBB染色した場合、上から下までラダーなバンドがみられるはずです。 ３０Kあたりとその下にしかバンドが見えないということは、タンパクがうまく流れていないと思います。一方、マーカーはうまく流れているようなので、ゲルは大丈夫です。 なので、予想されている通り、サンプル調整がうまく行ってないと思われます。 Doさんの言われているように１×SampleBufferで回収する、もしくは研究室のマニュアルではなく、一般的な生化学系の教科書に載っているようなLysisBufferを使ってみてはどうでしょうか？

違う要因･･･． 削除/引用 No.116-19 - 2007/09/03 (月) 16:42:33 - 6487 sea さん >少しずつ全体像が見えてきましたね。 違う原因が見えてきました･･･． >レインボーマーカーが流れている、ということなので、電気泳動自体は問題なさそうですし、シグナルが何にも出ない、ということは最終的に膜に何も転写されていない可能性が高いですね。 下の私のコメントのように、ゲル自体に30kDaのバンドしか転写されていないようです。 そうはいっても、一応下のような可能性はまだ考えたほうがよさそうですね。 (1) サンプルの問題でサンプルはうまくゲル上を流れていない 　3xSDSには行っている色素は流れています． 　sample自体がどうなっているのか知る方法があるのでしょうか． 　もっとも、タンパク自体が壊れている可能性がある気がするのですが･･･． (2) 電気泳動はサンプルも含めうまくいっているがその後転写がうまく行っていない (3) 転写はうまくいっているが、シグナル検出までの過程で問題がある 泳動後ゲルのCBB染色の結果から、sample調整から問題のようです． ちなみに3回ぐらい凍結融解を繰り返したsampleです． タンパクにとって凍結融解はどの程度のダメージがあるのでしょうか． 基本、これまでのラボ1回使いきりです。 今回は思ってもみずdetect出来無かったので、分注していませんでした．

その後 削除/引用 No.116-18 - 2007/09/03 (月) 16:28:41 - 6487 えーっと さん １）ゲルと膜を染色したとありますが、膜はどの段階で染色しましたか？発色反応の後ですか？ 今日もろもろのゲルや膜ををCBB染色してみました． 1.泳道直後のgel： 　30kDa付近に一本バンドが見えました． 　後は下のほうにつれて濃くなるスメアがありました． 　原因はsample調整の段階が高いようです・・・． 2.(一応)転写後のgel： 　1．と同様に30kDa付近に一本バンドが見えました． 　スメアというより、この30kDaのバンドの下にぼんやりとしたバンドもどきが見　えます。 3.転写直後の膜： 　 　今MillQで脱色中ですが、真っ青です。 ２）ゲルの染色結果はどうでしたか？高分子側はタンパク質が残っていると思いますが、低分子側はほとんどタンパク質がなくなっていますか？ 1．で申し上げたようにバンドの下、1cm位から低分子側にスメアを引いています． ３）レインボーマーカーはほとんどメンブレンに移っていますか？ 　はい。少しも残らず転写されています．(色的に) sample調整の段階で、proteaseのコンタミでもおきたのでしょうか． 別のトピ立てしないといけないような感じです･･･．

失敗談 削除/引用 No.116-17 - 2007/09/01 (土) 20:24:50 - XXX 転写に問題がありそうという事ですが うちのラボでも過去に転写がうまくいかなかったケースがありました。 転写のセットの時に膜をメタノールに浸すのを忘れた研究者や +とーを間違えてセットした研究者がこれまでにいました。 レインボーマーカーが膜にきちんと移っているようなら我々のラボでの失敗とは違うということになりますが・・・。

トラブルシュート 削除/引用 No.116-16 - 2007/08/29 (水) 17:06:41 - sea 少しずつ全体像が見えてきましたね。 レインボーマーカーが流れている、ということなので、電気泳動自体は問題なさそうですし、シグナルが何にも出ない、ということは最終的に膜に何も転写されていない可能性が高いですね。 そうはいっても、一応下のような可能性はまだ考えたほうがよさそうですね。 (1) サンプルの問題でサンプルはうまくゲル上を流れていない (2) 電気泳動はサンプルも含めうまくいっているがその後転写がうまく行っていない (3) 転写はうまくいっているが、シグナル検出までの過程で問題がある (1) は電気泳動直後にCBB染色をすることでわかりますね。 (2) もすでに指摘されているようにゲルを2枚用意して、ゲルだけ染色、と 転写直後に未処理のまま膜だけ染色、として比較することで情報が 得られそうです。 それより何より、えーっとさんがご指摘されているようにレインボーマーカーが膜へうまく転写されているかどうか、についてのコメントを頂くのが先かもしれないですね。 セミドライ式とウェット式(タンク)を比べると、ウェット式の方が転写にムラが出来たりトラブルの経験が多く、なんか不安定な印象です。 私は、現在ウェット式でやるときは必ず転写後にメンブレンをPonceauSで染色して全体的にムラなく転写が出来ているかどうかを確認してからシグナル検出に移っています。手間もほとんどかからないので。 このほかのTipsについてはレインボーマーカーについてのコメント待ち、ということで。 いつも長文になりすみません・・ ちなみに、5%skim milk x30min at RT でブロッキングして、その後ECLでシグナル検出をしたあとでも、PonceauSでも目で見て判別できるくらいにバンドを検出してくれました。 もっとも6487さんの場合は転写後すぐに染めた方がいいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.116-15 - 2007/08/29 (水) 16:27:21 - えーっと 6487さん ＞＞今日もタンパク量を倍（40ug）にしてTweenを0.2％と0.02％でWesternして、ゲルと膜のCBB染色をしてみましたが、前回と結果は一緒でした． （20-30kDa付近にバンドが一本見えるだけ）。 とありますが、ひとつお聞きしたいことがあります。 １）ゲルと膜を染色したとありますが、膜はどの段階で染色しましたか？発色反応の後ですか？ ２）ゲルの染色結果はどうでしたか？高分子側はタンパク質が残っていると思いますが、低分子側はほとんどタンパク質がなくなっていますか？ ３）レインボーマーカーはほとんどメンブレンに移っていますか？ どうでしょうか？

ポジコン。 削除/引用 No.116-14 - 2007/08/29 (水) 16:06:31 - 6487 ＞Do さん 自分でポジコンをとられたらいかがでしょうか？ ３T３などの適当な細胞をlysisするだけです。 ポイントは濃いめに作ることです。 WBでバンドが濃すぎたら、次回は少なめにアプライすれば良いだけですし。 ここでは2種類の培養細胞しか使っておらず、3T3でも手に入れるのはちょっと状況的に難しいです． でも、今後の参考にしたいと思います． 最後に３×SDSsampleBを混ぜているとのことですが、細胞をPBSで洗った後、PBSで１×にしたSDSsampleBで直接lysisでき、軽くソニックしたらボイルし、そのままアプライできます。 １×SDSsampleBをlysisBとして使えるので濃いめのサンプルが簡単にとれます。 そういう取りかたも出来ますね． ここでは、ソニケーションしてないので装置がありませんが･･･． 以上、長くなりましたが、サンプルもタンパク量が薄いんじゃないのというのが私の感想です。 いえいえ。大変参考になりました． タンパク量としては40ug applyして、出なかったので十分量使用してると思っているのですがなぜか、不思議なくらい出ません． これでもか！というくらい濃いめに流してみた方がいいと思います。 汚くてもバンドが出た方が、気が楽ですし、改善の余地があります。 そうなんですよー。 全く出ないと何をどうしていいのやら･･･． たくさんの皆さんの助言を頂いているので、なんとかActinぐらいは出したいと思います．

まだ出ません･･･． 削除/引用 No.116-13 - 2007/08/29 (水) 15:52:52 - 6487 seaさん レス、有難うございます． 多分過去にも結構似たような話題が出たと思いますが。。 はい。 似たようなケ−スで悩んでる方の話題もありましたが、 sample調整が少し他の方と違うので書き込んでみました． (0) バンドが全くでない、ということですが、メンブレンが全体的に何もシグナルがないのか、目的の分子量にないのか、全体のバックグラウンドが高くて何も見えないのか、一応書いていただいた方がいいと思います。 メンブレン全体的に全く何も見えません． 何もメンブレンを置いていないかのように何も出ません． (1) サンプルがゲル上にしっかり流れているかどうか、そしてそれがメンブレンに転写されているかどうか、が重要だと思います。レインボーマーカーなどの色付きマーカーも含めて電気泳動を行い、(すでに指摘されているように)転写後にゲルとメンブレンの両方をCBB染色やPonceauS染色をして確認してみると問題の切り分けにいいと思います。 今日もタンパク量を倍（40ug）にしてTweenを0.2％と0.02％でWesternして、ゲルと膜のCBB染色をしてみましたが、前回と結果は一緒でした． （20-30kDa付近にバンドが一本見えるだけ） (2) 色付きマーカーがゲル上をしっかり流れているときは、電気泳動用のゲルやバッファーに問題がある可能性は低いと思います。 しっかり分離もされていますし、buffer（TGS）は成功している方のを使っているので問題ないと思います． (3) マーカーが流れているのにゲルもメンブレンも染まらない場合は、サンプルに問題がある場合(量が少ない、サンプルバッファーと混合していない、など)と転写に問題がある場合があると思います。転写前にゲルを染めてみると転写に問題があるのかどうかもはっきりすると思います。 これをまだしていないので、やってみようと思います． (4) 転写に問題があった場合、使っているメンブレンについての情報も書いて頂けるといいとおもいます。私たちのラボでもウェット式ですが、例えばAmershamのPVDF膜はメタノール20%ではメタノール濃度が高すぎるようです。 PVDFです。 メタノールは何％でしていますか？ 私たちのラボもよく問題が起こってはトラブルシュートをしていますが、一人でやっているとやっぱり労力がかかって大変なので、supervisorとかに力を貸してもらいながらトラブルシュートできる方がいいと思うんですけどね。 余談ですが、今日実質解雇通知をされました． pH.Dももっているし、それなりに実験できるはずなので、とここではいわれているので力になるヒトといえば前のラボの方くらいでしょうか． ここでのWesternは始めて3週間ですが、確立された系でここまでActinすらでないということで「むいてないんじゃない？」と実質の解雇通知です． あと、3週間です． これは余談ですので、スルーして下さい． ありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.116-12 - 2007/08/29 (水) 01:38:34 - えーっと Tさん ご助言ありがとうございます。 そうですね、ブロッキングしているというのをすっかり忘れてました。もしかすると見えない可能性もありますね。私もブロッキング後に染めたことはありません。 なので、一からWBをやり直して、段階的に調べていくことをお奨めします。

(無題) 削除/引用 No.116-11 - 2007/08/28 (火) 23:54:01 - Ｔ ブロッキング後のメンブレンを染めてバンドが見えるものなんですか？ PVDF なら見えるかもしれませんが。

転写 削除/引用 No.116-10 - 2007/08/28 (火) 20:42:37 - えーっと 6487さん メンブレンにバンドが殆ど見られないということは、転写自体がうまく行ってないのではないでしょうか？ 通常、転写後のメンブレンをCBBで染めた場合、レーンの上から下まで（下の方が濃い）ラダーなバンドが見られると思います。 CBB染色でタンパク質が落ちてしまうということは考えられにくいですし（プロテインシーケンサーでは染色した部分を切り抜いて使いますので）、また、数回の発色反応でタンパク質が全部はがれるとも思えません（はがれたらリプロービングなんて出来ませんので）。 なので、今回の問題は転写がうまく行ってないのではないでしょうか？ 次回WBやるときはゲルを２枚用意して、１枚のゲルはSDS-PAGE後そのままCBB染色、もう１枚のゲルは転写後にCBB染色して２つを比べてみてください。同じようなパターンのバンドが見られたら、転写がうまく行ってないということです。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.116-9 - 2007/08/28 (火) 16:29:58 - Do ご自分でポジコンをとられたらいかがでしょうか？ ３T３などの適当な細胞をlysisするだけです。 ポイントは濃いめに作ることです。 WBでバンドが濃すぎたら、次回は少なめにアプライすれば良いだけですし。 最後に３×SDSsampleBを混ぜているとのことですが、細胞をPBSで洗った後、PBSで１×にしたSDSsampleBで直接lysisでき、軽くソニックしたらボイルし、そのままアプライできます。 １×SDSsampleBをlysisBとして使えるので濃いめのサンプルが簡単にとれます。 以上、長くなりましたが、サンプルもタンパク量が薄いんじゃないのというのが私の感想です。 これでもか！というくらい濃いめに流してみた方がいいと思います。 汚くてもバンドが出た方が、気が楽ですし、改善の余地があります。

CBB染色 削除/引用 No.116-8 - 2007/08/28 (火) 10:12:00 - 6487 ＞えーっと　さん まず、前回と全前回のメンブレンのCBB染色 (biorad safe-Coomassieで1時間) をしたところ、30-40KDa付近に薄いバンドが見えただけでした． 目的のタンパクの分子量のところにバンドはなく、 この見えたバンド1本だけでした。 そして、それ以外のバンドは見えませんでした． これは染色の問題ですか？ タンパクが落ちてしまっているのでしょうか． 今日、Tweenの検討をしてみます． ＞Caspase　さん レス有難うございました。 ここのラボでは、NP40でタンパク抽出してから上清を移し、 濃度測定してから必要量のタンパク量(ex.20ug)をとり、 １xになるように3ｘSDS buffer (NEB)、1/10 vol DTTをそれぞれ加え、 95℃で5分 boilしapplyしています． したがってapplyするときはのotal vol.はばらばらです。

(無題) 削除/引用 No.116-7 - 2007/08/28 (火) 05:10:00 - sea 幾つか気になることがあるのでちょっと書いてみます。 多分過去にも結構似たような話題が出たと思いますが。。 (0) バンドが全くでない、ということですが、メンブレンが全体的に何もシグナルがないのか、目的の分子量にないのか、全体のバックグラウンドが高くて何も見えないのか、一応書いていただいた方がいいと思います。(多分no signal、ということだと思いますが) (1) サンプルがゲル上にしっかり流れているかどうか、そしてそれがメンブレンに転写されているかどうか、が重要だと思います。レインボーマーカーなどの色付きマーカーも含めて電気泳動を行い、(すでに指摘されているように)転写後にゲルとメンブレンの両方をCBB染色やPonceauS染色をして確認してみると問題の切り分けにいいと思います。 (2) 色付きマーカーがゲル上をしっかり流れているときは、電気泳動用のゲルやバッファーに問題がある可能性は低いと思います。 (3) マーカーが流れているのにゲルもメンブレンも染まらない場合は、サンプルに問題がある場合(量が少ない、サンプルバッファーと混合していない、など)と転写に問題がある場合があると思います。転写前にゲルを染めてみると転写に問題があるのかどうかもはっきりすると思います。 (4) 転写に問題があった場合、使っているメンブレンについての情報も書いて頂けるといいとおもいます。私たちのラボでもウェット式ですが、例えばAmershamのPVDF膜はメタノール20%ではメタノール濃度が高すぎるようです。 ほかにも要素はたくさんあると思うのですが、まずは上記のような問題の切り分けのために情報を集めてみてはいかがでしょうか？ 私たちのラボもよく問題が起こってはトラブルシュートをしていますが、一人でやっているとやっぱり労力がかかって大変なので、supervisorとかに力を貸してもらいながらトラブルシュートできる方がいいと思うんですけどね。 助けになれば幸いです。

まさかとはおもいますが... 削除/引用 No.116-6 - 2007/08/27 (月) 18:14:56 - Caspase 細胞溶解液をboilする前にSDS sample bufferを加えていますか？ 示されたプロトコールでこのステップが抜けていると思うのですが...

CBB染色 削除/引用 No.116-5 - 2007/08/27 (月) 17:53:18 - 6487 えーっと さん。 レス、有難うございます. ほとんどの試薬は購入したものや、うまくいってる人が使ったのものです. 用事調整といえば transfer bufferくらいです。 Tween入りskim milk/PBS or TBSは使いまわしていますが、 うまくいっていないので用事調整してみます。 ゲルはもうありませんが、メンブレンはあるので CBB染色を発見したので早速実行してみます。 その結果を見て、また条件検討してみたいと思います. 大変参考になりました． ありがとうございました.

(無題) 削除/引用 No.116-4 - 2007/08/27 (月) 16:55:24 - えーっと すべての試薬をうまくいっている人からもらって試してみましたか？この系は研究室自体ではうまくいっているようですが、自分で試薬を作成した際思わぬミスをしてしまっているかもしれません。 あとは、どのポイントで失敗しているのか調べるために、段階的に調べてみてはどうでしょうか？ ゲルに流すタンパク質が少なすぎても多すぎてもうまくいかないので、サンプルを段階的に泳動してはどうでしょう（１、２、４、８，１６ulぐらいで）。 とりあえず、転写後にメンブレンとゲルを染色して、タンパク質がきちんとメンブレンに移っているか調べてはどうでしょう？ タンパク質がうまく転写されていれば、抗体反応の条件検討ですね。たとえば、tweenを0.05%にするとか、TBSで試してみるとかでしょうか？ 参考になれば幸いです。

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