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(無題) 削除/引用 No.1157-8 - 2008/05/19 (月) 21:54:31 - カナマイシン ちょっと説明不足でした。 誤）その断片が何kbくらいになるか計算しておく。 正）自分の増幅したい配列を含む断片が何kbくらいになるか計算しておく。

(無題) 削除/引用 No.1157-7 - 2008/05/19 (月) 21:53:01 - カナマイシン 適切な制限酵素（自分の増幅したい配列内には含まれない）でゲノムを完全切断。 →その断片が何kbくらいになるか計算しておく。 →アガロース電気泳動。 →ラダーのうち自分の欲しい配列が含まれるであろう位置を切り出す。 →ゲル溶出。 →溶出液をテンプレートとして増幅。 なんてのをよくやってました。けっこううまくいきました。 最近はプライマーを頼み直しちゃうようになってしまいましたが･･･

(無題) 削除/引用 No.1157-6 - 2008/05/19 (月) 11:52:55 - gDNA アドバイスありがとうございます。 皆さんからご指摘のありました中で、一番の自分の問題点はprimerの長さかと思います。 今まで、通常の（目的遺伝子発現の確認）PCRを中心にしていたため、 1.5kbまでは現在自分が使っている20mer前後で問題はなかったのですが、今回のケースはprimerの変更が一番の解決策のように思われますので、 新しいPrimerを注文しつつ、DMSO添加やアニーリング温度の検討、テンプレートの量の変更などを行って、試したいと思います。 ちなみに、素人の質問で申し訳ないのですが、DMSOやベタインを入れる意義（効果）はどのようなことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1157-5 - 2008/05/19 (月) 10:57:47 - AP >しかも、目的のサイズ（約4kbp)のバンドが弱く、目的以外のサイズがたくさん確認できます。 目的サイズ以外は、みんなそれより小さいということでいいですか。 小さい方が増えやすいので、プライマーにミスマッチがあってもこっちのほうが選択的に増えるということはあります。 予想より大きなバンドが強いようでしたら、サイクルの回しすぎ、鋳型が多すぎ、酵素過剰が関係している可能性があります（PCR産物の重合）。 ＞cycle数は30cycleで、extension timeは酵素のプロトコールに従い4分、テンプレートとしているgDNAは20ngを使用していますが、テンプレート量が多いのでしょうか?ycle数が多いのでしょうか? ゲノムの複雑さ（ゲノムサイズ）によりますが、ヒトゲノムの場合でも1 ngくらいが標準ではないでしょうか。多くても少なくてもうまくいくときはうまくいきますが。 私ならどうするかというと（もう試しているいることもあるとおもいますが） 1) プライマー配列を設計し直す。30 nt 前後の長めに設定する。これが一番効果的だと思います。 2) 酵素を変える。特性、特長の違う酵素でやってみる。Taq, ExTaq, LA Taq, AmpliTaq Gold, KODなど、 3) Hot starかそれに近い方法をとる。プライマーがユニークなはずなのにノンスペが増えるのは、サーマルサイクラーが十分高温にならないうちにノンスペシフィックなアニールが起こり、そうなるとあとは100 %マッチのアニールサイトを持ってしまい、いくら条件を厳しくしてもあたりまえにPCRがかかってしまうというのが大きいです。 Hot star系の酵素でなくても、調製は氷温で行い、酵素が入ったら速やかに、あらかじめpre-heatステップ (90度以上）に達したサーマルサイクラーに、チューブをセットするといい感触です。 4) 上と同様の理由で、反応のし始めの数サイクルはうんと厳しめのアニール温度にする。Tm ぎりぎりで、ノンスペにPCRがかからないようにしながら、ある程度、正当なターゲットを増幅してから、アニール温度を下げて増幅を促す。

(無題) 削除/引用 No.1157-4 - 2008/05/19 (月) 10:28:03 - ~ これからの進め方案については既に書かれていますので、条件について少し >適当なアニーリング温度にて 目的の増幅が起きるのが"適当"なアニーリング温度です。 どの位条件検討されているのか分かりませんが、 プライマーのTm値から計算された値は必ずしも"適当"ではない場合があります。 非特異バンドが多いのでしたら、3~5度ずつあげてみてはいかがでしょうか。 温度にグラディエントがかけられるサーマルサイクラーがあると、1回ですみます。 >酵素 プライマーや条件を変えずに、酵素を変えるだけで、増幅が全く変わることもあります。 ラボに他に酵素があるのでしたら、試してみてはいかがでしょうか。 （他に増えているバンドがもっと増えてしまうかもしれませんが…） >primer プライマーの長さは対象となる生物にとって適切な長さですか？ 私ならば、マウスやヒトであれば、30mer前後にします。 ヒトの場合だと、Alu配列などをプライマーにすると、シングルバンドはまず出ないという結果になります。 >Cycle数 サイクル数が気になるのでしたら、15サイクルあたりから、数uLずつサンプリングして流してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1157-3 - 2008/05/19 (月) 10:15:33 - Pumpkin 実験によりますが、目的のフラグメントサイズが増幅されてバンドが見えているのであれば切り出してクローニングしてしまえばよいと思いますが、非特異的な産物が出ては問題でしょうか。目的の増幅産物の量が欲しいということであれば、切り出したDNAにたいして2nd PCRをかければ、たいていよく増やせるとおもいます。 2ndPCRすることも変異が入るかもしれないという観点からはあまり変わりないですが、DMSOなどを使うと変異が入る可能性も少なからずあがりますのでクローニングするのであればバンドが出ている以上、プラスミドに入れてシークエンスされたほうがいいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1157-2 - 2008/05/19 (月) 03:18:31 - おお DMSOやベタインはやってみる価値があると思います。 アニーリング温度については、バンドが出てこないところまであげるとその系(酵素やプライマー)が使えるかどうかと言う意味で納得が行くと思います。 テンプレートの量は特に多すぎるとは思えません。特異性を上げるためにテンプレート、プライマー、マグネシウムの濃度を下げることがありますが、私はあまりそういう条件検討は細かくしません。ここで一度話が挙がったと思いますが違う酵素に切り替えてみます。 もし、4kbpsのフラグメントをプラスミドなどに入れると言うことを考えているなら、非特異バンドが増えていてもそこを切り出せばいいかと思います。 そのフラグメントは繰り返し配列を持っていて、その配列上にプライマーを設定してないかだけは確認できるのなら確認した方がいいかもしれません。

gDNAからのPCR 削除/引用 No.1157-1 - 2008/05/19 (月) 01:20:35 - gDNA 現在genomic DNAからのPCRを行なっていますが、完全に路頭に迷っています。 primerを設計し、適当なアニーリング温度にてPCRをかけているつもりなのですが、 PCR条件（アニーリング温度など）を何回行なってもラダーの状態になってしまいます。 しかも、目的のサイズ（約4kbp)のバンドが弱く、目的以外のサイズがたくさん確認できます。 cycle数は30cycleで、extension timeは酵素のプロトコールに従い4分、テンプレートとしているgDNAは20ngを使用していますが、テンプレート量が多いのでしょうか?ycle数が多いのでしょうか? 以前にこのフォーラムで教えていただいたDMSOを加える方法などで解決可能なのでしょうか? 質問が曖昧でしたら申し訳ございませんが、ご教授お願いいたします。

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