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(無題) 削除/引用 No.1152-3 - 2008/05/18 (日) 23:30:50 - ~ >midi−prep後にはベクターのみでインサート部位が泳動で確認できませんでした。一応シークエンスしてもやはり読めませんでした。 これは、どのような結果を表現しているのですか？ ヌルベクターを2cutして切り出されるフラグメントが検出されたとも、 ヌルベクターや外れの配列が読めたとも書かれていないので、 midi後にとったベクターが汚くて、 制限酵素で切れずに、シーケンスも走らないという状態でも、 書かれた結果になります。 >�@ 別のスレで、流すDNA濃度を濃くしたら見えたという書き込みを見ているのでしたら、 ここで聞く前に、DNA濃度を検討したらどうですか？ 何ngを切ったのかも、検出限界が何ngの条件なのかも書いていないのに、 濃い薄いの話を聞かれても、それが原因かもしれませんね位しか答えようがありません。

(無題) 削除/引用 No.1152-2 - 2008/05/18 (日) 13:05:41 - おお 目的のプラスミドを持つ大腸菌がmidi−prepで増えていないということだと思います。 サブクローニングでとれた大腸菌をストリーキングしてシングルコロニーを数個ひろい、ミニプレップして、インサートの入っているプラスミドをシーケンスすればいいかと思います。インサートの入ったプラスミドをもつ大腸菌がないなら、ミニプレップしたプラスミドをもう一度大腸菌に入れ直しても良いかと思います。また、シーケンスのためならmidi−prepの必要はないのではとも思います。 なぜ目的のプラスミドを持つ大腸菌がmidi−prepで増えていないかはいろいろあると思います。 一つは単純なコンタミ。 あと、大腸菌はトランスフェクション直後は複数のプラスミド(プラスミドA、Bとしましょう)が入っていることがあります。大腸菌はおなじoriのプラスミドはなるだけ片方を排除して一つにしようとします。ですから、AとBが入った大腸菌はコロニーはAの入った大腸菌とBの入った大腸菌のmixtureになることがあります。こういう場合あなたの目的のプラスミドが、大腸菌で増えるのに不利であると、段段とポピュレーションが減ってきて、違うプラスミドに変わってしまったように見えることがあるようです。 大腸菌がそのDNA断片を嫌っている場合もあるかもしれません。こういう場合は、長期間の4度のストック、グリセロールストックをさけ、得られたプラスミドをトランスフォーメーションするところからいつも始めるのがベターです。 > > �@スケールアップ前に見られていたインサート部位がスケールアップ後に見 > られないのは単にDNA濃度の問題なのでしょうか？ 質問の意味が分かりません。 >�A400ｂPくらいの時と比べると150位の短いものではベクターに入りにくいな >どの問題点などがあるのでしょうか？ DNA断片が短い方が入りやすいです(その配列が大腸菌に悪影響がないというのが前提です)。

短いＰＣＲ産物からのシークエンスがうまくいかない 削除/引用 No.1152-1 - 2008/05/18 (日) 11:06:07 - プローブ いつもお世話になっております。 150bpくらいのPCR産物を切り出し、ベクターに挿入し大腸菌でクローニング、試験管でカルチャー（5ml）したのちに250mlにスケールアップしてmidi−prepしてABIシークエンサーでシークエンスを行っています。 最終的な目的はIN　SIU　HYBRIDIZATION用のRNAプローブ作成です。 実際に行ってみると、スケールアップ前ではmini-prepして制限酵素で切断するときれいにDNAバンドが入っていることが確認できたのですが、スケールアップ、midi−prep後にはベクターのみでインサート部位が泳動で確認できませんでした。一応シークエンスしてもやはり読めませんでした。 以前400bpくらいで同様の手技をしていた時は失敗したことはなく、不思議に思っていました。 最近のスレで似たような内容のものがありましたので質問させていただきましたが、�@スケールアップ前に見られていたインサート部位がスケールアップ後に見られないのは単にDNA濃度の問題なのでしょうか？�A400ｂPくらいの時と比べると150位の短いものではベクターに入りにくいなどの問題点などがあるのでしょうか？

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