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(無題) 削除/引用 No.115-4 - 2007/08/29 (水) 12:02:20 - sora 皆さんお答えありがとうございます。 今回は腎臓で発現の少ない膜タンパクを何とかwesternで検出したいので濃縮の意味で分画をやっています。 ＞2と3の間に，15000gで10分程度の遠心を挟むと，良いかと思います。 やってみます。 ＞膜成分の場合には最初のホモジナイズのときの処理によって断片化や小胞化などが左右されるため、結局どの画分にenrichされるかはそれぞれの成分をサンプリングして一度確認してからでないとわからない部分がある そうなんですね！知りませんでした・・・ 単純に粗膜画分をとればいいと思ってました・・・ 全部の画分でやってみます。

(無題) 削除/引用 No.115-3 - 2007/08/29 (水) 10:12:30 - 通りすがり 粗膜画分といったときは細胞膜やらvesicleやらを含めた二重膜成分をもった いろんなオルガネラの集合体でけっこう広い意味であるのに対して ミクロソーム画分といったときはホモジナイズ処理によって小胞化した細胞膜の一部の成分と粗面/滑面小胞体の成分が主でもうちょっと狭い定義になるんではなかったでしょうか。 基本的に >1.組織をﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ >2.3000×ｇ15分遠心2回 >3.上清を100000×ｇで30分遠心、沈殿を粗膜画分とする このやり方の場合 ３のあとでは沈殿に含まれるのは ミトコンドリア+ リソソーム+ペルオキシソーム+小胞体成分+細胞膜の一部などになります。 これを粗膜画分というかどうかはうーーんと人それぞれでしょうね。あんまり定義として聴いたことはないですが。 そこで酵母屋さんのおっしゃてるように2と3の間に 15000g(動物細胞だと7000gぐらいでも十分です)で 10分程度の遠心をかけると沈殿として 粗ミトコンドリア画分が落ちてきて ミトコンドリア+リソソーム+ペロキシソームなどが沈殿で そのほかのミクロソーム画分+可溶性画分などが上澄みとして 有る程度分けられるので後のstepで純度を気にするなら入れるべきでしょうね。 ただ膜成分の場合には最初のホモジナイズのときの処理によって断片化や小胞化などが左右されるため、結局どの画分にenrichされるかはそれぞれの成分をサンプリングして一度確認してからでないとわからない部分があるので 一口に膜タンパクといってもどのような画分を精製すればよいかは タンパクの種類などによります。

ミクロソーム 削除/引用 No.115-2 - 2007/08/29 (水) 09:26:32 - 酵母屋 動物細胞での遠心条件は経験がなく分かりませんが， 酵母の場合，ほとんどのミトコンドリアは，3の沈殿画分に回収されます。 2と3の間に，15000gで10分程度の遠心を挟むと，良いかと思います。 ただ，リソソームや細胞質膜など他の膜成分を除く方法も考えないといけないのではないでしょうか。

分画について 削除/引用 No.115-1 - 2007/08/27 (月) 13:13:23 - sora 今膜タンパク質を調べています。 基本的な質問で申し訳ないのですが、粗膜画分とミクロソーム画分の違いがいまいちわかりません。 参考にした粗膜画分の分画の仕方がミクロソーム画分ではないかと思ってしまうのですが・・・ 参考にしたものがいけないのですかね？ ちなみにそのやり方は 1.組織をﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ 2.3000×ｇ15分遠心2回 3.上清を100000×ｇで30分遠心、沈殿を粗膜画分とする でした すみませんがよろしくお願いします。

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