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(無題) 削除/引用 No.1149-7 - 2008/05/18 (日) 16:56:46 - おお >[Re:6] abcさんは書きました : > ちなみに、組み換えDNAの導入操作ですが、 > コンピテントセル0.1mlに組み換え体プラスミド（pUC19：：Em）液5μl（10ngDNA相当量）を加える。 > 0.9mlSOC培地を加え、37℃1時間培養。 > 培養した菌液10μl、IPTG液20μl、SOC培地50μlをLB/X-gal/Amp平板にまく。 > です。 まず、これは、前回のコメントと合わせますと、pUCをHind 3で消化し、EM耐性遺伝子(Hind 3フラグメント)をライゲーションしトランスフォーメーションしたということでしょうか? コントロールを取っていらっしゃらないので、このプロセスがうまくいっているかどうかの判断材料がないです。とはいえ、白が出てきているようなので、白優先でミニプレップしてみればいいかと思います。得られたコロニー数がそんなに多くないので30個やってしまってもいいかとも思いますが、それは実験者の環境にもよりますので判断はおまかせします。 これでインサートが入っていれば、よかったということで今回はいいと思いますが、ちょっと効率が悪いのが気がかりです。EM耐性遺伝子の大きさはどのくらいでしょうか?大きくて効率がわるかったのか、それともお使いになっているコンピテントがベストでないのか、そのた手技上の問題なのか判断ができませんが、 手技、コンピテントなどがよくないと、今回はよくても少し難し目(といっても従来ちゃんとやれば難しくはない)のコンストラクト作成の時、何度やっても取れないとか悲しい目にある可能性があります。 お時間のある時に過去ログでこの手のトピックスをお読みになることを勧めます。 古いBioTechnicalフォーラム（readのみ）の方にもかなりトピックスがあると思います。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi > > 結果は青コロニー13、白コロニー18、形質転換効率3.1×10＾5でした。 マイクログラムあたりのコロニー数ということで効率を示しますが、この計算は間違えています。再考してみてください。

(無題) 削除/引用 No.1149-6 - 2008/05/18 (日) 15:44:29 - abc 早々の回答ありがとうございます。 かなり細かい点までご指導ありがとうございます。 簡単にしか考えていなかったので、とても勉強になりました。 ちなみに、組み換えDNAの導入操作ですが、 コンピテントセル0.1mlに組み換え体プラスミド（pUC19：：Em）液5μl（10ngDNA相当量）を加える。 0.9mlSOC培地を加え、37℃1時間培養。 培養した菌液10μl、IPTG液20μl、SOC培地50μlをLB/X-gal/Amp平板にまく。 です。 結果は青コロニー13、白コロニー18、形質転換効率3.1×10＾5でした。

(無題) 削除/引用 No.1149-5 - 2008/05/18 (日) 13:53:22 - おお 補足致します。 このようなブルー/ホワイトセレクションができるプラスミドにインサートをいれても、ブルーになることがあります。理由はインサートを入れてもフレームが維持されていて、LacZの機能が維持されている場合があるからです。インサートが短いほどブルーになる可能性が高いです。

(無題) 削除/引用 No.1149-4 - 2008/05/18 (日) 12:26:38 - おお http://www.fermentas.com/techinfo/nucleicacids/mappuc1819.htm 5'-terminal part of the lacZ gene encoding the N-terminal fragment of beta-galactosidase (source - M13mp18/19). This fragment, whose synthesis can be induced by IPTG, is capable of intra-allelic (alfa) complementation with a defective form of beta-galactosidase encoded by host (mutation lacZDM15). In the presence of IPTG, bacteria synthesise both fragments of the enzyme and form blue colonies on media with X-Gal. Insertion of DNA into the MCS located within the lacZ gene (codons 6-7 of lacZ are replaced by MCS) inactivates the N-terminal fragment of beta-galactosidase and abolishes alfa-complementation. Bacteria carrying recombinant plasmids therefore give rise to white colonies. 実際にpUCにのっているLacZは全長ではなくフラグメントです。で、この遺伝子上にマルチクローニングサイトを置いています。理想的にはこのマルチクローニングサイトにほかのDNA断片を入れると、活性をもったLacZが合成できないため(ストップコドンが入ったり、長いアミノ酸配列によるN末とC末の分断)ブルーセレクションができる大腸菌でもLacZ活性がなく、白になるという仕組みです。 活性をもったLacZと書きましたが、LacZは全長ではなくフラグメントとも申し上げています。意味するところはこのフラグメントだけであると、活性は生じません。大腸菌が、それを補足できる残りのフラグメントを発現してないといけません。たぶんブルーセレクションできる大腸菌とそうでない大腸菌があるのはお気付きになっているかと思うのですが、、、 Em耐性は貴方がどの様に遺伝子を挿入したか、などに依存します。 "アミノ酸配列をコードする部分を大腸菌が持っているプラスミドを持っている = 発現する(耐性になる)"ではありません。

補足 削除/引用 No.1149-3 - 2008/05/18 (日) 11:51:57 - abc 最初の質問（Em遺伝子を持つ組み換えベクターで形質転換された大腸菌コロニーはなぜ白いのですか？）が漠然としていてすみません。 補足します。 プラスミドベクター：pUC19をHind�Vで消化。 標的断片：Em耐性遺伝子 形質転換後、LB/X-gal/Amp平板にまく 以上のような操作です。 Em遺伝子を持つ組み換えベクターで形質転換された大腸菌コロニーはEm耐性を持っており、lacZの転写・翻訳がおこらず、β-ガラクトシダーゼが生成しないので、X-galを分解できないため、白色コロニーができたと考えたのですが、どうでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1149-2 - 2008/05/18 (日) 04:30:02 - おお もう少し詳しい情報を提供してください。プラスミドの名前とか。

Ｅｍ遺伝子の白コロニー 削除/引用 No.1149-1 - 2008/05/18 (日) 01:39:21 - abc Em遺伝子を持つ組み換えベクターで形質転換された大腸菌コロニーはなぜ白いのですか？

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