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(無題) 削除/引用 No.1148-6 - 2008/05/18 (日) 09:54:33 - AP 最近は、コンピは買って使うのが当たり前みたいになって便利になりましたが、反面、基本的なことを学ぶ機会が失われてしまうみたいで残念です。 コンピーテントセルを作るとき、何のためにシングルコロニーをとるのか理解する必要がありそうです。 多くの場合、宿主菌が目的の機能を果たすためには、F'エピソームやある種のプラスミドを保持していなければなりません。ところが、継代培養や大量培養をしているうちにそれらを失う細胞が出現します。 そうなると、blue/white selectionができなくなったり（空のベクターが入ってもコロニーが青くならない）、タンパク質発現系のコントロールに必要な遺伝子（たとえばLacIやT7 RNA polymerase）が欠損したりします。 だから、コンピを作るときは、必要なエピソーム、プラスミドを保持しているクローンをM9最少培地や薬剤で選択してから殖やす必要があるのです。 いや、この場合選択の必要はないんだ、ということならわざわざプレートにストリーキングしてシングルコロニーをとらなくていいくらいです。 Tn5を持っていると言うことは、必要なエピソーム/プラスミドを保持しているクローンをカナマイシンで選択するためではないかと思いますが（株名をあげてくれていたら、すぐわかったことですが）、確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.1148-5 - 2008/05/18 (日) 04:59:14 - 0518 皆様お騒がせしました。コンピテントセルには薬剤耐性遺伝子が組み込まれていると思い込んでいました。今回用いるコンピテントセルはTn5 transposonを有していたもんで。

(無題) 削除/引用 No.1148-4 - 2008/05/18 (日) 03:43:23 - おお > > あと、コンピテントセルを作るときに培地に抗生物質を入れない理由がわかりません。 > > 細胞（壁）にダメージを与えるのを防ぐためかなと思っているのですが。 > コンピテントセルに既にAmpなどの耐性遺伝子が入っているとしたら，形質転換後にどのようにせれくしょんをかければいいのですか？ うむ、、、、やはりその辺の根本的な所が分かってらっしゃらないのでしょうか、、、、

(無題) 削除/引用 No.1148-3 - 2008/05/18 (日) 03:38:43 - TK-1 >[Re:1] 0518さんは書きました : > これまで、市販のコンピテントセルを買っていたのですが > 大量に必要なため今回自分でエレクトロポレーション用 > コンピテントセルを作製しようと考えています。 > > 市販のエレクトロポレーション用コンピテントセルの > グリセロールストックを数μlLBアガロース（抗生物質不含）に塗ったところ、 > 培地一面にコロニーが形成されシングルコロニーを得ることができませんでした。 > > こういう場合、シングルコロニーを得る為にはどのような培地に塗ればよろしいのでしょうか。 > 初歩的な質問ですが、よろしくお願いします。 うすめてください。 > > あと、コンピテントセルを作るときに培地に抗生物質を入れない理由がわかりません。 > 細胞（壁）にダメージを与えるのを防ぐためかなと思っているのですが。 コンピテントセルに既にAmpなどの耐性遺伝子が入っているとしたら，形質転換後にどのようにせれくしょんをかければいいのですか？

(無題) 削除/引用 No.1148-2 - 2008/05/18 (日) 03:37:59 - おお あなたが、何個の大腸菌をプレイトにまいたか考えると、シングルコロニーが取れない理由が分かるのではと思いますが、、、 画線培養(ストリーキング)をするか、薄めてまくかどちらかだと思います。たとえは下のホームページの下の方(ホームページないをStreak Plate Techniqueで検索すればいいと思います)に図解しています。 http://www.personal.psu.edu/faculty/k/h/khb4/enve301/301labs/lab4pureculture.html 抗生物質は大腸菌によっては入れた方がいいものもあります。エピソームに薬剤耐性マーカーが入っていて、それを維持するという目的です。

コンピテントセルの作製 削除/引用 No.1148-1 - 2008/05/18 (日) 01:00:33 - 0518 これまで、市販のコンピテントセルを買っていたのですが 大量に必要なため今回自分でエレクトロポレーション用 コンピテントセルを作製しようと考えています。 市販のエレクトロポレーション用コンピテントセルの グリセロールストックを数μlLBアガロース（抗生物質不含）に塗ったところ、 培地一面にコロニーが形成されシングルコロニーを得ることができませんでした。 こういう場合、シングルコロニーを得る為にはどのような培地に塗ればよろしいのでしょうか。 初歩的な質問ですが、よろしくお願いします。 あと、コンピテントセルを作るときに培地に抗生物質を入れない理由がわかりません。 細胞（壁）にダメージを与えるのを防ぐためかなと思っているのですが。

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