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(無題) 削除/引用 No.1142-5 - 2008/05/17 (土) 12:31:46 - おお > ＞何をベースに2ー3倍 > pNL-lucのみの系でのルシフェラーゼ活性を１とした時です。 何がインターなるコントロールかという質問です。例えばルシフェラーゼをつかったプロモーターアッセイでプロモーターに変異をいれてワイルドタイプと比べる時でも、たんに、それぞれのをトランスフェクションした、細胞のルシフェラーゼの活性を比べるのでなく、トランスフェクションの効率が見積もれるように構成的に発現するマーカ-をトランスフェクションします(LacZとかデュアルのルシフェラーゼとか)。そのマーカーをインタ-ナルコントロールとして、ルシフェラーゼの活性をソノインターナルコントロールの値で割った数字で比較するわけです。 >そのとおりだと思います。pNL-lucと空ベクターでDNA総量はあわせてあるのですが この空ベクターは何を使ってますか?比較という意味では、GFP-shRNAのプラスミドからプロモーターをのこしてGFPを抜いたものでないと比較できないと思いますが。ただ、そんな細かいことをする意味はあまりないと思いますが、、、、、 > このようにルシフェラーゼを使用する場合は、GFPを含むベクターは使用しないべきなのでしょうか？？ 2倍ぐらいのさなのであまり大きな違いはないと判断して良いのではというのが私の感想です。インターナルコントロールをとったプロモーターアッセイでさえ、2倍の差は生物学的に優位とはそれだけでは言い難いので、発表するのはそれだけでは難しい状況です。それぐらいの差なら、あなたの実験で適切なコントロールを取っていればまず問題がないと思います。 気になるならGFPが発現しないベクターを使っても良いと思いますが。それであなたが考えている"問題"と思っている事が解決するかどうか定かではありません。そもそも、ノックダウンの効果を見る実験をするのに、2倍の底上げがあったとしても問題になりますでしょうか?

ありがとうございます。 削除/引用 No.1142-4 - 2008/05/17 (土) 11:18:36 - ふぇく ＞DNAの総量が違うと、トランスフェクションの効率に影響がでる そのとおりだと思います。pNL-lucと空ベクターでDNA総量はあわせてあるのですが、GFPあるなしでルシフェラーゼ活性に影響はでるものなのでしょうか？？ ＞何をベースに2ー3倍 pNL-lucのみの系でのルシフェラーゼ活性を１とした時です。 このようにルシフェラーゼを使用する場合は、GFPを含むベクターは使用しないべきなのでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.1142-3 - 2008/05/17 (土) 03:49:52 - おお >[Re:1] ふぇくさんは書きました : > pNL-lucのみトランスフェクションした場合よりもルシフェラーゼ活性が2〜3倍増強してます。 何をベースに2ー3倍と見積もってますか? pNL-luc単独と、GFPなどのマーカーをミックスしたものではもう実験系が違いますし、

(無題) 削除/引用 No.1142-2 - 2008/05/16 (金) 17:59:11 - ~ DNAの総量をあわせるために、pNL-lucのみのサンプルではpNL-lucが他のサンプルよりも多いということはありませんよね。 おそらく、pNL-lucの量が同じで、他のベクターをさらに加えていて、DNAの総量が異なっているのだと思います。 DNAの総量が違うと、トランスフェクションの効率に影響がでるかもしれませんので、 他のベクター(GFP無し?)でDNA量をあわせてみてはいかがでしょうか。。

GFPとルシフェラーゼ 削除/引用 No.1142-1 - 2008/05/16 (金) 14:52:10 - ふぇく 現在、pNL-Lucを用いてshRNA発現プラスミド（ベクター内にGFPあり）の抗HIV-1効果を確認しています。そこでshRNAカセットが入っておらず、GFPのみの空ベクターとpNL-luc、またshRNA（LacZ）発現ベクターとpNL-lucでコトランスフェクションしているサンプルは、pNL-lucのみトランスフェクションした場合よりもルシフェラーゼ活性が2〜3倍増強してます。この増強される原因が全く分からないのですが、どなたか解決策をご存知でしたら御教授お願いします。

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