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(無題) 削除/引用 No.1141-14 - 2008/05/18 (日) 03:56:36 - おお >[Re:13] うさんは書きました : > 話をぶったぎってしまいますが。 いえいえ、正論だとおもいます。ただプロテアーゼインヒビターを入れないプロトコールはあまり見ないので当然入れてると思えましたし、私の場合も大腸菌から直のライセイトでも結構25kDaあたりに来るものがおおかったので。 たしかに、プロテアーゼインヒビターの濃度、種類を増やすと幾らか改善する可能性がありますね。あと、可溶画分に幾らか取れているのであればOKとすると言うのもその通りとおもいます。幾らか条件を試してみるのはいいかと思いますが、条件検討にはまってしまわないことも大切です。と言うのも劇的な改善がない場合も多々ありますから。

破砕が問題じゃあないでしょうか 削除/引用 No.1141-13 - 2008/05/16 (金) 21:58:14 - う 話をぶったぎってしまいますが。 現状で、目的タンパクが必要なだけ可溶性画分に発現しているのであれば、 発現量が下がるリスクを背負ってまで低温培養をする前に、 破砕条件を考えた方が良いのではないでしょうか？ プロテアーゼインヒビターやEDTAは入れてますか？ 破砕条件を変えてみてもよいかもしれません。 * B-PERは知りませんでした。 　タカラのHPを見ると、使い勝手がよさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.1141-12 - 2008/05/16 (金) 17:05:13 - ndk そっか、 コールド系ならなんとなく理解できますね。 しかし、１５度とかでも誘導させたことがないので、 ぜひやってみたいと思います。 １５度なら、プロテアーゼもそうそうは働かないですよね？ でも、それだけ発現誘導の時間も長くなるわけだから、 いちがいに、その条件が必ずというわけでもないようですね…。 発現系って難しいですね。

(無題) 削除/引用 No.1141-11 - 2008/05/16 (金) 16:34:30 - B > > ４℃で48hで誘導しました。 > 4度で誘導というのはすごいですね。確かにほかの大腸菌ではせいぜい十数度までですね。 この誘導というのはIPTGのような誘導ではなくてT社のコールド系 （低温誘導）のベクターを使うということでは？

(無題) 削除/引用 No.1141-10 - 2008/05/16 (金) 14:21:51 - おお あ、あとGSTカラム精製のあと、透析するのであれば、目的のものと分子量がそこそこ離れているならば透析のサイズを目的のものとGSTの間のものをつかい、除いてしまうのもありかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1141-9 - 2008/05/16 (金) 14:16:13 - おお > ４℃で48hで誘導しました。 4度で誘導というのはすごいですね。確かにほかの大腸菌ではせいぜい十数度までですね。

(無題) 削除/引用 No.1141-8 - 2008/05/16 (金) 13:52:47 - とも すべての大腸菌が低温でうまく誘導できるかわかりません。 ストラタジーンのArcticExpress competent cellは低温で誘導できます。 ４℃で48hで誘導しました。 しかし、僕のタンパクはうまくいきませんでした。 いろいろ誘導条件変えてやっていますが。。。

(無題) 削除/引用 No.1141-7 - 2008/05/16 (金) 13:37:14 - ndk すごい！ 一週間ですか！！ 教科書に載っていることだけが全てじゃないんですね。 ご助言ありがとうございます。 参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.1141-6 - 2008/05/16 (金) 12:34:26 - おお > しかし、大腸菌は意外と低温で培養できるものなんですね…。 > その時は発現誘導の時間も長めにしたほうがよいのでしょうか？ オーバーナイトぐらいでも良いかと思います。ほとんど増えない状態で一週間培養し続けると、可溶画分に活性のあるタンパクが得られたと言う話も聞いたことがあります(GSTかどうか分かりませんが)。そこまでする必要はあるかどうか分かりませんが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1141-5 - 2008/05/16 (金) 11:26:32 - ndk ご助言ありがとうございます。 私はこのGST融合たんぱく質をMBP融合たんぱく質との免疫沈降実験に使用するために、作製しています。 そうですね、みなさんのおっしゃるようにもう少し低温での培養を行ってみようと思います。また、培地の検討も行う価値がある気がします。 しかし、大腸菌は意外と低温で培養できるものなんですね…。 その時は発現誘導の時間も長めにしたほうがよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1141-4 - 2008/05/16 (金) 11:00:58 - おお >[Re:2] ともさんは書きました : > ソニケーションのときに壊れることもあります。 > ソニケーションではそう簡単にタンパクは切断されないと思いますが、処理のときにプロテアーゼ(非特異的)にアタックを受けたのではと思うのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.1141-3 - 2008/05/16 (金) 10:53:45 - おお 私も何種類かGST融合タンパクを大腸菌から精製したことがありますが、25kDaあたりにGSTに対する抗体で染まるタンパクが結構とれます。このあたりのバンドはマルチプルに出てくることが多いので非特異な切断だと思っています。GSTと目的の物をつなげるところ(リンカー)に、Thrombin-siteとか入れているものが出回ってますが(私が普段使ってるのはfactor Xですが)たぶん、リンカーは、プロテアーゼのがアクセスしやすいようにアルファーヘリックスとかベーターシートのような構造をとらないように設計してあるようなきがします。ですから、特異的なプロテアーゼでなくても、そういう所が優先して切れるのでGSTだけかそれに近い分子量のフラグメントが目立っているのではないかと思ってます。 解決策は目的、Thrombinで切るのかどうかで変わってくると思いますが、Thrombinで切るならGSTの部分だけのフラグメントは単独でついたままですし、切ってしまえば何とかなるかもしれません。それにThrombinの混入を避けるためにさらに精製するならきれいなものが取れるのではないかと思います。 わたしはGSTのついたままで実験してましたので、GSTカラムで得られた短いフラグメントをふくんだものを、Qカラムでさらに精製したこともあります。 大腸菌内で切れてしまわないようになるべくするのならば低温の培養(15度くらいまで下げる人もいます)とか、バイチを最小バイチにしてなるべく余分なタンパクを作らないようにするなどが考えられますが、劇的な改善は見られるかどうかは分かりません。

(無題) 削除/引用 No.1141-2 - 2008/05/16 (金) 10:53:25 - とも ソニケーションのときに壊れることもあります。 たぶんこの現象は誰でも経験すると思います。 できるだけ、低温でカルチャーしたり、精製時にゲルろ過するなど工夫が必要かと。 ４度で誘導できる大腸菌などがありますので試してみては？？

GST融合タンパク質に関して 削除/引用 No.1141-1 - 2008/05/16 (金) 10:17:45 - ndk はじめまして。 GST融合たんぱく質の発現を行っています。 発現誘導後、抗GST抗体を用いたウエスタンブロットで発現状態を確認しました。そうしたところ、確かに予想される分子量の位置に目的タンパク質と思われるシグナルは確認できるのですが、25 kDa付近にも強いシグナルが確認できました。その量比は圧倒的に25 kDa付近のシグナルが強く検出されています。目的タンパク質とGST-tagの間に存在するThrombin-siteが内在性のプロテアーゼで切断されてしまったのではないかと考えているのですが、どなたか、このような経験をされた方はいらっしゃらないでしょうか？ 宿主はBL21 培地はLBA 系は5 ml 発現誘導は0.1 mM IPTG、25℃で3時間 細胞の破砕にはB-PERという大腸菌破砕用のデタージェントを用いています。 よろしければ、解決策やご助言等お願いします。

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