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(無題) 削除/引用 No.1140-19 - 2008/06/06 (金) 04:36:51 - pcr HpyCH4IIIで問題なく切れました。 原因はよくわからないのですが、 泳動のbufferを制限酵素付属のbufferに変更し、 またpcr プロダクトのアニーリング温度をあげました。 結局何が原因だったのでしょうか・・・？？

(無題) 削除/引用 No.1140-18 - 2008/05/16 (金) 16:29:35 - B > NEBのHpyCH4IIIを使用しています。NEBでは37℃インキューベートが > Fermentasでは65℃インキュベートになっていました。 > しかもFermentasは37℃だと活性が低下するというようなことが > 書かれていました。 > バッファー組成についてもあまり知識がないので、 > この二つのメーカーの違いもよくわかっていない状況です。 横レスですがHpyCH4IIIを一度使ってみようかと思ったのですが かなりマイナーな酵素なのでちゃんと切れるか不安になって 最終的に使うのを諦めたことがあります。この2つのメーカー どちらでもいいのですがトピ主さん以外で使われた経験のある方 問題なく使えたのか今後のために情報を書き込んでいただけませんか。 お願いします。

(無題) 削除/引用 No.1140-17 - 2008/05/16 (金) 15:27:01 - AP ＞なるほど、そうなんですね。メジャーな酵素は結晶化までしているのが可也あるので、純度などに問題がなく、結構平気とも思いますが(というか結構長持ちするのですが)、 最近では、メジャーな酵素や精製が難しくてヌクレアーゼやプロテアーゼがコンタミしてきやすい酵素などは、由来細菌からの精製から、recombinatにどんどん切り替えらてきていますしね。 昔は失活させないように、ずいぶん気をつかって取り扱っていましたが、今では精製も保存液もよくなって、室温に放置し忘れても、どこかに分けて送ったりするにも普通郵便でも、ほとんどの場合、大丈夫らしいです。 しかし、recombinantでない酵素は、失活のしやすいのが今でもかなりあるのではないかとにらんでいます。 ところで、 ちょうちょマークのN社は自社開発のisoschizomer製品を出すのに熱心なように見受けられますが、パテント料を省いて安く製品を売るためかなにかでしょうか。思い出すのは、ClaIが結構高いところ（今はrecombinantになって値が下がっているみたいですが）、N社のisoschizomerがえらく安くでて、こりゃいいと思って買ったら、前に書いたような次第で。いくら安くても新参者は信頼できない、広く長く使われてきたものにはそれなりの実績と理由があるということを学びました。

(無題) 削除/引用 No.1140-16 - 2008/05/16 (金) 15:04:06 - ぽー TAKARAのBsp1286 Iを使ったときに、NEB1では切れなかった記憶があります。 そのあとPCRからやり直してTAKARAのL bufferで切った時には問題なく切れたのでBufferの問題だと考えてますが、他の理由がないとは言い切れないですね。

(無題) 削除/引用 No.1140-15 - 2008/05/16 (金) 14:50:21 - EJ N社はSibEnzymeのOEMらしいです。 横から失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.1140-14 - 2008/05/16 (金) 14:43:35 - おお 情報としてある程度いえることは、実際制限酵素を販売している会社は、実際は製造している会社からバルクで買い小分けしているとききます。で販売している会社ほど製造会社はないので、違う会社が売っていても、製造元は一緒というのが可也あるようです。Fermentasはもともと製造して、各販売会社に提供していた会社だそうです。ですから、あなたの使っているSとかTaとかToとかNとかPとかDとかRとかの酵素はFermentasがつくった酵素かもしれませんよ(Fermentasが参入してきた時にとある代理店から聞いた話です)。

(無題) 削除/引用 No.1140-13 - 2008/05/16 (金) 14:33:06 - おお > N社の珍しい制限酵素や、他社で出している一般的な制限酵素に対するisoschizomerは、経験的に失活しやすいです。 なるほど、そうなんですね。メジャーな酵素は結晶化までしているのが可也あるので、純度などに問題がなく、結構平気とも思いますが(というか結構長持ちするのですが)、そういう酵素でさへ昔はプロテアーゼのコンタミなどで結構失活してしまうことがあったようです。レアーなこうその場合はプロテアーゼの問題か、活性自身が安定してないのか分からないですけどね。

(無題) 削除/引用 No.1140-12 - 2008/05/16 (金) 14:20:15 - AP いわゆるUniversal buffer (Low, Middle, High）準拠のバッファーなら、 どこの会社のを使っても変わらないとおもいます。 制限酵素は使い慣れた数社の中から、その時々、安く売っているのを買うので、 メーカーは統一されていません。バッファーと酵素のメーカーがまぜこぜにするのは日常的にごくふつうにやっていますけれど、それが理由で切れなかったことは経験がありません。 同時に多数の酵素を使う場合や同時多重消化を行うとき、T社のEcoRIにはT社のH, I社のPstIにはI社のREact3、N社のSalIには#3とか面倒くさいことはやりませんし（誰もやらんか）。 そういう問題が起こりうる特別な酵素やバッファーあるのなら、後学のために私も知っておきたいです。 今では、当然のように反応バッファーがおまけについてきて、使い切れずにストックばかり増えるという感じですが、昔は酵素単品販売と言うことが多くて、反応バッファーは自前で作っていたものです。Molecular Cloningなどの実験書もそれを前提に書かれていましたからね。それでもちゃんと動いていました。 メーカーに聞けば、おそらく自社のバッファー以外は推奨しませんというでしょうが、よくあるように、それは無用なトラブルを避けるため、苦情が来たときのトラブルシューティングで検討するファクターを減らすため程度の理由でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1140-11 - 2008/05/16 (金) 12:42:24 - おお 違う会社のバッファーなどで、切れたとか切れないと言う話なら伏せずに酵素名、バッファーの種類、会社名を公開してもいいんでないでしょうか。そちらのほうが情報交換という意味では役に立つと思いますけど。 私は酵素の特性をチェックして、酵素と違うメーカーで使えそうなのを選ぶことは多々ありますけど、切れなかったことはないです。たしかにすべての組み合わせをやったことはないですし、マイナーな酵素などは使ったこともないものもいっぱいありますので絶対に大丈夫とはいいませんが。

(無題) 削除/引用 No.1140-10 - 2008/05/16 (金) 11:00:25 - ぽー 参考程度に・・・・ http://wiki.symplus.co.jp/doku.php/bio/%E5%88%B6%E9%99%90%E9%85%B5%E7%B4%A0%E3%81%AE%E3%83%90%E3%83%83%E3%83%95%E3%82%A1%E3%83%BC 同じLow Salt Bufferでも会社によって微妙に組成が異なっています。（他のBufferでも同じことが言えますが）組成が違えば同じ酵素であっても至適温度や活性が違うことがあっても不思議ではないと思います。Ｔ社の酵素をＮ社のBufferを使って切ってみたら切れなかったってことはたまにありますから。

(無題) 削除/引用 No.1140-9 - 2008/05/16 (金) 10:45:41 - AP ＞うまく切断されないのですが、 これはまた別の問題ですが、 N社の珍しい制限酵素や、他社で出している一般的な制限酵素に対するisoschizomerは、経験的に失活しやすいです。 同じように保存しているのに、いつのまにかそれだけ切れなくなっていたり。安いisoschizomerを見つけて大喜びで買ったら、トラブった苦い経験です。

(無題) 削除/引用 No.1140-7 - 2008/05/16 (金) 10:07:49 - AP Fermentas でTaaI（HpyCH4III）とあるのは、TaaIがHpyCH4IIIの「別名」という事ではなく「isoschizomer」（おなじ認識配列を切断する由来の異なる酵素）だということです。由来細菌が異なれば当然、至適温度やバッファーの違いによる切れ具合がことなります。 この場合も、温度だけでなく、たとえばH/M/Lバッファーを使った場合の切れ方が違うようですね。会社によって判定基準が違うかもしれませんが。 ご存じのように、制限酵素の名前は由来細菌の学名の頭文字から付けられます。TaaIはThermus aquaticus由来、つまりあのTaq polymeraseと同じ、好高温性の細菌由来だから、至適温度が高いのは当然かと。 よく使う酵素ではTaqIもそうですしTで始まる酵素、それとBではじまるBacillus由来の酵素なんかは至適温度が高いのが多いですね。

(無題) 削除/引用 No.1140-5 - 2008/05/16 (金) 09:21:51 - Caspase 酵素が同じでも反応温度などの条件が違うのは最終的な反応溶液の組成に依存するのではないでしょうか。 注意したいのは同じ酵素名でもメーカー各社で意外と酵素の"保存液"の組成、特に塩濃度が異なることがままあります。 私はこの点で何度か痛い目に会っています。(笑) 比較的日本のT社とアメリカ(?)のN社は互換性があるように思いますが念のため確認しています。

(無題) 削除/引用 No.1140-4 - 2008/05/16 (金) 08:53:45 - おお FermentasはTaa1でしょうか。きっと認識部位切断部位が同じ、違う酵素なのではないかと思います。ですからバッファーは違う会社でも良いですが、酵素は買った会社の条件でやるべきと思います。

(無題) 削除/引用 No.1140-3 - 2008/05/16 (金) 01:16:01 - pcr NEBのHpyCH4IIIを使用しています。NEBでは37℃インキューベートが Fermentasでは65℃インキュベートになっていました。 しかもFermentasは37℃だと活性が低下するというようなことが 書かれていました。 バッファー組成についてもあまり知識がないので、 この二つのメーカーの違いもよくわかっていない状況です。 初心者ですので、色々アドバイスお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1140-2 - 2008/05/16 (金) 00:55:23 - A あくまでも私見ですが、至適温度は理論的にではなくメーカーが 実験的に確認しているでしょうから例えばバッファーの組成などが 違えば至適温度が異なることはありえると思います。 個人的にそのような例を見たことがないのですがもし問題なければ 具体的な制限酵素名とメーカー名を書いてもらえませんか？もし 誰かがその制限酵素を使っていれば何らかのアドバイスがもらえる かもしれませんし。

メーカーによる制限酵素インキュベート温度の違い 削除/引用 No.1140-1 - 2008/05/16 (金) 00:40:27 - pcr 同じ制限酵素でメーカーによって至適インキュベート温度が異なる制限酵素 を使用しています。うまく切断されないのですが、 メーカーによってバッファーなどが違えば同じ制限酵素でも、 インキュベート温度が異なることがありますか？ 　よろしくお願いします。

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