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(無題) 削除/引用 No.1137-7 - 2008/05/17 (土) 00:24:57 - ジジ ダイターミネーター法です。 とするとやはり別々のチューブでフォワード・リバースを使ってシークエンスしないといけないわけですね！

(無題) 削除/引用 No.1137-6 - 2008/05/16 (金) 07:26:59 - ~ >ジジ さん シークエンス方法は何でしょうか？ シークエンス方法は世界に1つしかないというわけではないので、 ジジさんの使っている装置や試薬によって、できる場合とできない場合があります。 ダイプライマー法で、それぞれのプライマーについている標識が異なる場合には一度に反応することができます。 (LI-COR社の4300シリーズなど) http://www.technosaurus.co.jp/techno/prod/index_licor001.html ダイターミネーター法であれば、両プライマーからの伸長産物を識別できるシークエンサーを見たことがありません。

(無題) 削除/引用 No.1137-5 - 2008/05/16 (金) 00:15:40 - ジジ 同一のチューブにフォワードとリバース両方入れてシークエンスした場合 うまく全長がよめるのでしょうか？ 初めてシークエンスをしているので基本的な質問で申し訳ありませんが教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1137-4 - 2008/05/15 (木) 23:22:03 - ~ 目的の配列が増えているかを確認するために、PCR産物の"全長"を読みたいのですね。 >全長読むには同じテンプレートでフォワードとリバース両方で別々にシークエンスした方がよいのでしょうか？ #2の書き込みを読んでいないということでしょうか。 PCR産物の"全長"を読むことが目的であれば、 PCRした際の片側のプライマーでのシークエンシングだけでは不足しています。 プライマーの真上や直後も読めるようなすばらしいシークエンス法を使っているのでもない限り、 読めない部分は#2に書かれています。 >同じテンプレートでフォワードとリバース両方で別々にシークエンスした方がよいのでしょうか？ 500bpのPCR産物であれば、別に、フォワードとリバースでシークエンシングする必要はありません。より内側に設計したプライマーの組み合わせでも、全長読むことができるでしょう。 ただ、あえて別のプライマーを作らなくても、多くの場合はフォワードとリバースで全長を読むことができるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1137-3 - 2008/05/15 (木) 22:48:13 - DNA 目的の物が増えているかのチェックのためのシークエンスです。 およそ500bpくらいのものなのですが全長読むには同じテンプレートでフォワードとリバース両方で別々にシークエンスした方がよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1137-2 - 2008/05/15 (木) 22:37:49 - ~ そのシークエンスの目的は何でしょうか？ フォワードのプライマーのみでシークエンスすると、 フォワードのプライマーの真上や、プライマーから数十bp位まで、 長いPCR産物だとシークエンス反応が届かないほど遠く は読むことができません。 読めない部分に、必要な情報がある場合には、フォワードのプライマーのみではだめです。 大体目的の物が増えているというチェックであれば、フォワードのみで読めば確認できるでしょうけれども、 クローニング時のコロニーPCRで当たりかどうかの判別であれば、全長読まなければ、目的が達せられません。 >目的バンドを切り出して ということは、複数のバンドがある中で、目的のバンドがどれかの確認をしようとしているのでしょうか。 そうであれば、同じプライマーで増えるホモログなどがある場合では、 目的外のフラグメントの配列との違いがわかるところが読めるプライマーを選ばないと、 目的のバンドなのかの確認ができないでしょう。

DNAダイレクトシークエンス 削除/引用 No.1137-1 - 2008/05/15 (木) 21:38:12 - DNA PCR後に目的バンドを含むゲルを切りだして、スピンカラムで DNAを溶出して行いましたが、 シークエンスの際に用いるプライマーはフォワードのみでいいのでしょうか？ 基本的な質問で申し訳ありませんが御教授ください。

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