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(無題) 削除/引用 No.1130-19 - 2008/05/16 (金) 00:59:07 - B >[Re:17] APさんは書きました : > ＞その血液を回収し遠心して得られた上精を一次抗体として用いています。 > > アフィニティー精製はしていないという事ですね。 > 免疫抗原（精製したタンパク質）に対するアフィニティー精製をするのが先決ですね。 > 血清中には他にたくさんの免疫グロブリンが存在していて免疫抗原に対する抗体はせいぜい1 %くらいです。その他大勢のなかに、目的のタンパク質以外に反応する抗体があるのはよくあることです。 > > 特に今回ウサギ（無菌飼育されていない場合が多い）で細菌のタンパク質をターゲットにしているので、免疫抗原以外の細菌由来タンパク質二対する抗体が存在する可能性は極めて高いです。 > > 抗原カラムを作るためのレジンは各社から出ているし、難しい手技ではないです。 > それでも交差反応が出るようなら、材料の菌のアセトンパウダーで前吸収したものを使うとよいです。 > > ＞　それは非特異のバンドの方が目的たんぱく質より濃いため、 > とのことで、交差反応するタンパク質の方が量が多そうですし、目的のタンパク質に対する抗体は他に比べて量が多いはずですので、交差性の抗体を吸収させ、目的の抗体だけ残せる見込みがあります。

(無題) 削除/引用 No.1130-18 - 2008/05/15 (木) 15:28:43 - Bac 　有難うございます、さっそくアフィニティー精製を行ってみようと思います！ 　皆様たくさんの親切丁寧なアドバイス有難うございました。知らないことがたくさんあり、是非とも今後の実験に取り入れようと思います。 また宜しくお願いします＾＾

(無題) 削除/引用 No.1130-17 - 2008/05/15 (木) 13:41:29 - AP ＞その血液を回収し遠心して得られた上精を一次抗体として用いています。 アフィニティー精製はしていないという事ですね。 免疫抗原（精製したタンパク質）に対するアフィニティー精製をするのが先決ですね。 血清中には他にたくさんの免疫グロブリンが存在していて免疫抗原に対する抗体はせいぜい1 %くらいです。その他大勢のなかに、目的のタンパク質以外に反応する抗体があるのはよくあることです。 特に今回ウサギ（無菌飼育されていない場合が多い）で細菌のタンパク質をターゲットにしているので、免疫抗原以外の細菌由来タンパク質二対する抗体が存在する可能性は極めて高いです。 抗原カラムを作るためのレジンは各社から出ているし、難しい手技ではないです。 それでも交差反応が出るようなら、材料の菌のアセトンパウダーで前吸収したものを使うとよいです。 ＞　それは非特異のバンドの方が目的たんぱく質より濃いため、 とのことで、交差反応するタンパク質の方が量が多そうですし、目的のタンパク質に対する抗体は他に比べて量が多いはずですので、交差性の抗体を吸収させ、目的の抗体だけ残せる見込みがあります。

(無題) 削除/引用 No.1130-16 - 2008/05/15 (木) 13:25:02 - りょう 1次抗体反応のbufferを工夫すべきでは？ スキムミルク、0.05-0.1%Tween20入りのblocking bufferなど。

(無題) 削除/引用 No.1130-15 - 2008/05/15 (木) 13:18:53 - Bac みなんさん多くのアドバイス本当にありがとうございます。 質問内容に至らない点があり申し訳ないです。具体的に述べますと、抗体はB.Subtilis菌の精製したあるタンパク質をウサギに二度免疫をして、その血液を回収し遠心して得られた上精を一次抗体として用いています。使用するときはTBSで希釈して用いています。二次抗体は市販で購入したGoat anti rabbit-IgG HRP conjugateを使っています。すでにその特異性を示す実験は行われています。 今回の実験ではB.Subtilis菌の近縁菌である菌においてそのタンパク質が発現等を調べています。 サンプルは培養した細菌を超音波破砕機で破砕し、遠心し上精を回収したものを用いています。 ウエスタンブロッティングをするときのメンブレンはPVDF膜を用いています。

(無題) 削除/引用 No.1130-14 - 2008/05/15 (木) 11:18:36 - mikan この掲示板で教えていただいたのですが、 �@疎水性の高い膜などがサンプルの場合、 ミルクブロックは避けたほうがよい。 （ゼラチン、非たんぱく系のポリビニル、 血清などでうまく行きました） �Aサンプルを加熱するとアグってしまい バンドが薄くなります。４０℃以下の 処理で検出量が増えました。 材料などが分からないのですが、 すべてこちらの先輩方にいただいたアドバイスです とてもうまくいっています。

(無題) 削除/引用 No.1130-13 - 2008/05/15 (木) 10:04:11 - AP ＞Bacさん プラクティカルな対処法はいろいろ書き込みがあるとおりとしても、 やはり、どのような実験系かという情報をある程度、公開してもらわないと、 骨折り損になりかねません。 抗体は購入あるいは他の研究者から供与されたものか、新規に作ったものなのか。 monoかpolyか。どの程度の精製がされているのか。 他から入手した抗体なら、実験例や性質の情報がデータシートや、論文、persocal communicationである程度手にはいるはずだけれど、そこに特記事項はないか、実験例ではそういう問題が起こっていないのか。今やっている実験と実験例では系に何か違いがあるのか（例えば、対象としているサンプルはそれぞれ何か）などなど、 また、サンプルは何か（培養細胞か、組織か、個体か）、どういう抽出方法か（whole lysateなのか分画か）、ターゲットの局在性はどこかなど。 場合によっては、目的のタンパク質と交差反応するタンパク質は局在や抽出される条件が違ったりするかもしれませんから、目的タンパク質に絞って分画して使う手もあると思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.1130-12 - 2008/05/15 (木) 08:56:41 - 〜 TOYOBOのCan Get Signalを試してみるのもひとつの手かと。 抗体によっては劇的に改善することがあります。

(無題) 削除/引用 No.1130-11 - 2008/05/15 (木) 02:39:54 - sea 複数バンド検出の理由は色々考えられますが、 すでにほかの方々が書いておられるので省きます。 抗体反応性に加えて分子量でみることで、特異的なバンドを 指摘することが出来るのであれば、非特異的と思われる バンドについてはそんなに気にしなくていいと思います。 ただ、たとえばモノクロを作っていて、その抗体の特異性を 示したい、とかでWBをやっている場合などには都合が悪いのかも しれません。 私は複数バンドが出て困る場合、どれが特異的なバンドか わかりにくくて困る場合には大体次のような対策をしています。 (A) 流すタンパク量を減らす (B) 一次抗体濃度を下げる (C) 抗原ペプチドが手に入る場合、吸着をして吸着処理の有無による バンドの変化を示す (D) タンパクのlysis buffer やpreparation methodを変える (E) タンパクの分画をとって特異的なバンドだけ検出できる分画で 以後話を進める (F) もしWBをnature, denatureの両方の状態で試していないのなら それも比べておく 購入した抗体の場合、抗原ペプチド・タンパクの入手可能性に加え 量も十分じゃないので、自分のところでのaffinity purificationは 現実的な選択肢に入ってこないことが多いです。 こんな感じです。

(無題) 削除/引用 No.1130-10 - 2008/05/14 (水) 22:44:11 - おお あまりやらないですが、抗体でブロットをインキュベーションするときのバッファーの塩濃度、デタージェント(tweenがよく使われるけどNPー40にしてみるとか)の種類や濃度、EDTAなどの添加、pHなども場合によって有効だったりします(こういうのをいじり出したら確かに切りがないんですけどね)。あとだまされたと思って、一次抗体を希釈した溶液にちょっとだけライセートを加えてみてください。

(無題) 削除/引用 No.1130-9 - 2008/05/14 (水) 20:00:25 - あべちゃん APさん、 横レスありがとうございます。 その通りです。私が間違っていました。 Bacさん、 ノンスペが抗体希釈でも改善しない場合は、ブロッキング剤を変えると嘘のように改善する可能性がある、程度に解釈してください。

(無題) 削除/引用 No.1130-8 - 2008/05/14 (水) 19:36:20 - AP 横レス ＞なぜなら、抗体量が変化したところで、目的／非特異的蛋白質どちらに対しても結合量がかわるだけです。 この実験では抗体濃度を変えても改善しなかったわけですが、 抗体濃度を変えても、特異反応も非特異反応も同じだけ量が減るだけだという認識は必ずしも正しくないです。 抗原抗体反応の結合係数は、抗体ごと、抗原ごとに異なります。 一般的に特異的反応は高く、非特異的反応は低いです。 結合係数が高ければ低濃度でも反応が進みやすいですが、 低ければ濃度の低下とともに急激に反応が起こりにくくなります。 抗体の力価をELISAで調べるとよくわかりますが、特異性の高い抗体だと濃度を低くしていても強度が下がりにくく、ほぼ横ばいのカーブになりますが、特異性の低い抗体やコントロールの正常血清だと、高濃度では特異的抗体に匹敵する強度を示しても、濃度の減少に比例してどんどん弱くなっていきます。 特異的反応の強度が十分で、非特異的反応が極力低くなるまで希釈率を上げると、特異的なシグナルだけを残すことができる場合はあります。 特異的反応も交差反応も結合係数があまり変わらない場合や、特異的反応でも結合係数が低い場合はうまくいきませんが。

(無題) 削除/引用 No.1130-7 - 2008/05/14 (水) 18:44:34 - あべちゃん <抗体濃度を変える、スキムミルク濃度を変える、ブロッティング時間を変える等 上記の方策は基本的に目的バンドにも非特異的バンドにも同様に影響を与えますよね。なぜなら、抗体量が変化したところで、目的／非特異的蛋白質どちらに対しても結合量がかわるだけです。既にスキムミルクでブロックしているにもかかわらず、目的バンドより非特異的バンドが強く出るという事は、スキムミルク内の蛋白質などが、非特異的バンドの蛋白質と抗体との相互作用を阻害していないのだから、濃度を変えてもだめですよね。 ブロッティング時間も同様にどちらにも同じファクターとして影響するでしょう。 こういうときに、私はブロッキング剤の種類を変えます。（スキムミルク、BSA、血清、カゼイン、市販のブロッキング剤などなど） ブロッキング剤を変えると、運が悪い時は目的バンドだけが消失したり、新たな非特異的バンドが現れたりします。しかし、運が良ければ非特異的なバンドだけが消えます。 それは、ブロッキング剤に含まれる蛋白質などが、非特異的バンドの蛋白質と抗体との相互作用する箇所をマスクするからだと思います。ブロッキング剤の種類によって、そのマスクする部分が異なるため、ある抗体に対してはとても有効、と言ったような事が起きます。 とはいえ、~さんが仰るように、目的バンドが検出され、非特異的バンドが目的バンドの検出を邪魔しないのであれば、それほど気にする事も無いと個人的には思いますが、Bacさんの実験目的次第ですね。

(無題) 削除/引用 No.1130-6 - 2008/05/14 (水) 18:43:29 - りょう non-specificではなく、あなたの抗体がその余計な蛋白にも特異的に反応しているのでしょう。要するにcross-reactのバンドではないかと思います。 抗原によるaffinity精製した抗体でそのようなことが起こっているなら、防げない気がします。 精製していないserumの状態なら抗X抗体と抗Y抗体の混合状態ですから、目的のバンドと余計なバンドが異なるIgによって認識されている可能性があり、精製によりバンドが消失するかも。

(無題) 削除/引用 No.1130-5 - 2008/05/14 (水) 18:39:47 - うう 抗体抗原反応は特異的なので、ノンスペがドバーッと出るのは上手く行ってないからなのか、もしくはその抗体のせいでしょう。 やはり特異的な抗体であるのなら２本以上のbandが出てしまうのは気持ち悪いですよね。 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.1130-4 - 2008/05/14 (水) 17:57:27 - ~ 目的のバンドは出ているのですよね。 非特異バンドが出ると、何か困るのですか？

(無題) 削除/引用 No.1130-3 - 2008/05/14 (水) 16:34:12 - うーん とりあえず見たい抗原、および使用している抗体についてメーカーやcloneなど詳しくお聞かせくださいますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1130-2 - 2008/05/14 (水) 16:33:17 - Bac ＞ブロッティング時間を変える ではなくブロッキング時間でした。申しありません。

ウエスタンブロッティングの非特異について 削除/引用 No.1130-1 - 2008/05/14 (水) 16:30:08 - Bac 　こんにちわ。 　今ウエスタンブロッティングを行っている者ですが、非特異で困っています。 　それは非特異のバンドの方が目的たんぱく質より濃いため、非特異を消そうと操作する（抗体濃度を変える、スキムミルク濃度を変える、ブロッティング時間を変える等）と非特異が薄くなると同時に目的のバンドが消えてしまうと言う事態に陥ってしまいます。 　こうすれば良い等アドバイスが御座いましたら、是非教えてください。よろしくお願いします。

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