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(無題) 削除/引用 No.1127-4 - 2008/05/14 (水) 16:00:30 - UC おおさん、APさん、ご返答ありがとうございます。 原理的には可能だろうと思いましたが、やったことが ないのでどうかなと思っていました。ABIのシークエンサー があるようなのでバージョンなど調べてみることにします。

(無題) 削除/引用 No.1127-3 - 2008/05/14 (水) 09:13:35 - AP 二方向からシークエンスをとれば、プライマー近位が読めなくても、反対側のシークエンスで補完できると思います。 シークエンス反応産物の精製は、EtOH沈殿ではなく、カラムか最近ABから出ているXTerminatorでもつかって、極力、短鎖のロスを防ぎ低分子域のノイズをきれいに除去した方がいいでしょう。 また、BigDyeを使っているなら、ver 3.1より1.1のほうがプライマー近位の波形がよく出ます。3.1は長い距離が安定した波形ででますが、プライマー近位は苦手です。+50 ntくらいまで読めないことがあるので、100 bpくらいの鋳型だと、両鎖読んでもオーバーラップがとれない可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.1127-2 - 2008/05/14 (水) 06:03:53 - おお できるか、できないかと問われればできます。リバースとフォアード両方でやれば、プライマーにちかくの読みにくい(実際に読めることもある)ところも読めますので、基本的に配列を決めることはできるはずです。

RT-PCRのproductをシークエンス出来ますか？ 削除/引用 No.1127-1 - 2008/05/14 (水) 03:17:02 - UC 　こんばんは。変な質問かも知れませんが、cDNAからリアルタイムPCR(SYBR Green I)をしていて、PCR産物のゲルチェックをしていたのですが、いくつかのサンプルでバンドがダブルに見えるものがあり、アイソフォームかなぁ、と思っているのですが、このバンドの塩基配列を確認したい場合って、このPCR産物を(適切に精製した後で)、かけたプライマーでシークエンス出来ないだろうかと思ったのですが。ただサイズが176bpなので、仮に読めたとしても途中からでしょうが。少なくともアイソフォームか、それとも全く違う配列かは分かるかなと考えたのですが。 　以前、普通のRT-PCR産物に対してTAクローニングをして、ミニプレ後にシークエンスというのをしたことはありますが、現在のラボでは大腸菌は扱っていないようですし、PCR産物を直接シークエンスに持って行けたら良いな、と思った次第です。

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