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(無題) 削除/引用 No.1125-10 - 2008/05/14 (水) 15:41:44 - おお あと、最近はキットも出回っていますので(使ったことがありませんので、善し悪しが分かりませんが)、適切な細胞の量とかはプロトコールにありますから、ある程度標準的なプロトコールで出来るかも知れませんね。

(無題) 削除/引用 No.1125-9 - 2008/05/14 (水) 14:24:33 - おお >[Re:6] ほんさんは書きました : > 核を沈殿させるときは３０００Ｇで５min遠心しています。最初は１０００G > で５min行っていたのですが、沈殿がまったくみえず不安だったので > ３０００Gに変更したところ、少し沈殿が見えたので。 不死化、あるいは癌細胞株で典型的なものであれば、結構核だけでも細胞を回収した時と同程度のボリュウムがあるような感じでかさばっているような感じで、回収できます。 スタートの細胞10cmdishから、1mlぐらいの系で回収した核は20-50ulぐらいのボリュームになるのではないかと思います。現在すこし理由があり10cmディシュ10枚から細胞を回収して、細胞のボリウムと同じ量のhypotonic bufferを使っていますが、HEK(293)で400から600ulぐらいのボリュームになります(これはある活性を維持するためにやっているので細胞のボリウムと同じ量のhypotonic bufferを使う必要はありませんが10cm dishで0.5から1ml程度の系ぐらいが妥当なんじゃないかなと思います)。多分細胞にもよりますが、もし、得られる核の容量が少なすぎるなら、細胞の調子など疑った方がいいかもしれません。それかhypotonic buffer処理中に可也早いスピードでアポトーシスでも起こすのかなあとか考えたりもします(ちょっと勝手に想像しているだけですが)。hypotonic buffer処理時間はある程度必要ですが、少し早く切り上げてもいいかもしれません。 細胞に直接hypotonic bufferと言う事ですが、それでもいいのですが、4度の温度コントロールがちょっと難しいかもしれませんので先にPBSかhanks buffered saline(糖が入っているのでPBSよりもいいかもとちょっと思います)で細胞を回収してから、hypotonic buffer処理をしても良いかとも思います。 > > ＞おおさん > > 核の裏打ちタンパクであるlaminBというタンパクを見ています。 laminだと、かなり核にドミナントのような気がします(単なる感ですけど)。抗体がノンスペを拾っているということは、、、多分ないでしょうけど、それを示している論文と同じ抗体ですか?あまり気にするところではないかもしれませんが、ちょっと気に留めておいた方がいいかもと思います。 > > あと質問なのですが、phosphate/protease inhibitortに > 　・100mM NaF > 　・ 1mM Na3Vo4 (バナデート) > 　・ 10mM Sodium pyrophosphate > 　・ 10μM Antipain > 　・0.5mM PMSF > 　・ 10μM Leupeptin > 　・ 10μM Aprotinin > > を使っています。これらに問題はあるのでしょうか？ > 何度もすみません。お願いします。 すべて濃度を覚えてないのですが、そんなに問題になることはないかなと思っています。ただし、NaFが100mMですよね。大抵のプロトコールで50mM以上は入れるようですが、Hypotonicで処理するために塩濃度を下げておいたにもかかわらず100mMもNaイオンを加えているというのが気にかかります。Hypotonic bufferでは10mMぐらいのカリウムを使うこともありますので、100mMNaFを20mMぐらいのKFに変えてもいいかもしれません。塩濃度を必要以上にあげると、細胞は壊しにくいのですが、壊れた時にいろいろなものを溶出するのを助けたりもします。 論文に示されている物と同じ細胞を使ってますか?もし違うなら、まず同じ細胞でやってみて感触を掴むと、何が違うかとか比較が可能になりますので修正しやすいかもしれません。 ちょっと完全に原因が分からなかったので思いつくことを長々と書きましたが、ちょっとでも参考になることがあれば幸いです。

NaF 削除/引用 No.1125-8 - 2008/05/14 (水) 13:50:47 - あべちゃん すみません。100mM NaFはやった事無いです。 10mM NaFなら、私の場合、問題が生じたことはないです。

阻害剤について 削除/引用 No.1125-7 - 2008/05/14 (水) 13:46:54 - あべちゃん ・100mM NaF ・ 1mM Na3Vo4 (バナデート) ・0.5mM PMSF 上記のものは大丈夫だと思います。 その他のものを添加して細胞質画分を調べた事が無いのでわかりません。 Rocheのcompleteも大丈夫。モリブデン酸ナトリウム、ベータ・グリセロフォス フェートも問題ないです。 はっきりとした事は言えませんが、最初の1000G 5minで沈殿が全く見えないという所に、何か問題点があるように思えるのですが。1000Gだったら、核が落ちてきても良いと思うのですが・・・ 低張処理後のサンプルを顕微鏡で確認されていますか？細胞膜が破壊され、小さな顆粒（核）が観られるはずですが。

(無題) 削除/引用 No.1125-6 - 2008/05/14 (水) 12:19:51 - ほん ＞あべちゃんさん 核を沈殿させるときは３０００Ｇで５min遠心しています。最初は１０００Gで５min行っていたのですが、沈殿がまったくみえず不安だったので３０００Gに変更したところ、少し沈殿が見えたので。 ここではあまり沈殿が見えなくても大丈夫なのでしょうか？？ その後の遠心は行っていませんでした。今度から行ってみます！！ ありがとうございます。 ＞おおさん 核の裏打ちタンパクであるlaminBというタンパクを見ています。 なぜか、細胞質画分の方に色濃くバンドが出てしまっていて、不思議に思っています。 スクレーパー作業が問題ないということなので、もう一度行って細胞状態を確認しながらやってみたいとおもいます。 ご親切にありがとうございます。 あと質問なのですが、phosphate/protease inhibitortに 　・100mM NaF 　・ 1mM Na3Vo4 (バナデート) 　・ 10mM Sodium pyrophosphate 　・ 10μM Antipain 　・0.5mM PMSF 　・ 10μM Leupeptin 　・ 10μM Aprotinin を使っています。これらに問題はあるのでしょうか？ 何度もすみません。お願いします。

(無題) 削除/引用 No.1125-5 - 2008/05/14 (水) 11:23:04 - おお まず、それは細胞質に微量で存在する可能性はないでしょうか。、細胞質フラクションの残り(遠心後、hight salt buffer でけんだくした一部をとりサンプリング)と比べて細胞数あたりで、どれくらいさがあるでしょうか。 いろんな可能性があると思いますが、例えばGFPなどにNLSをつけても、ごく一部の細胞に、細胞質がうっすらと、GFPの蛍光を持っていることがあります。M期をへて、細胞が分裂したあと、核膜が再編せいされますが、この時は核の中のものは細胞質にほりだされたままで核ができたあとで、そのたんぱく質が核に移行するような場合も考えられます。またたんぱく質の合成は細胞質で行われますから、このようなことを考えると全く細胞質にない核タンパクがあるのかと思えたりもします。いくら細胞質でも検出されたとしても全体の発現量の1%ぐらいなら、そんなものかもしれないと思いますし。 ま、理屈のようで屁理屈のようでもありますので、細胞質フラクションに来たあなたのタンパクが細胞全体の発現量実際に免疫染色とかで、核でシグナルが飽和するような状態でどの程度細胞質にシグナルがみれるかなど少し見てみればいいかと思います。 核を回収する時の遠心の強さはどれくらいでしょうか?強い遠心をかけるプロトコールもありますが、1000gぐらいでじゅうぶん落ちると思いますので、ゆっくりで遠心してみてもいいかもしれません。 スクレーパーはほとんど問題ないと思います。ガラスとテフロンを擦りつけるようなホモジナイザーを使うこともありますから。 あと確かに、hypotonic buffer で洗った方が核フラクションがきれいになるというのはあります。でもこれはバッファーの容量(細胞にたいしても)によるかもしれません。現時点で問題ないのであれば気にする必要はないでしょう。実験にもよりますので、コンタミの貴方の実験に対するインパクトを考えて判断すればいいかと思います。

Hypotonic処理後の上清 削除/引用 No.1125-4 - 2008/05/14 (水) 11:14:02 - あべちゃん 組成的には私も大体同じようなバッファーを使っています。 私の場合、低張破砕後、低速遠心（1.5kG 4min)で核を沈殿させます。その後の上清をどのようにしていますか？ 私は、再度高速で(13kG 10min)遠心して、その上清を細胞質画分にしています。Debrisを除去するのが主な目的だと思いますが、上清を回収する際に吸い取ってしまった核のコンタミも除く事ができると思います。

(無題) 削除/引用 No.1125-3 - 2008/05/13 (火) 20:38:04 - ほん ＞ＫＯさん 助言ありがとうございます。 洗浄はあまり行っていませんでした。核画分にはtubulinのバンドは出なかったので、よしとしていました。 細胞質画分に核にあるものが見えてしまうということは、スクレーパーで剥がす作業で核も壊れてしまうのでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.1125-2 - 2008/05/13 (火) 20:20:28 - KO バッファーの組成は常識的だと思います。 核をHypotinic bufferで洗っていますか？ 自分は二回洗います。 あと、actinなどは核に入りやすいので tubulinなどを細胞質のマーカーとして使ってみたら 綺麗に見えるかもしれません。 （そういう問題ではないのかもしれませんが）

Subcellular fraction　きれいに分けたい。 削除/引用 No.1125-1 - 2008/05/13 (火) 18:35:13 - ほん タンパクを細胞質と核画分とに分けてみたいと思っています。いくつかの論文を参考に行ってみたのですが、細胞質のほうに核にしかないタンパクのバンドが見えてしまっています。 論文ではきれいに分かれていたのですが、何か問題点はあるでしょうか？？ hypotonic buffer ・20mM HEPES (pH8.0) ・10％ Glycerol ・ 2mM MgCl2 ・ 1mM CaCl2 ・protease inhibitor high-salt buffer ・20mM HEPES (pH8.0) ・10％ Glycerol ・0.42M NaCl ・protease inhibitor ディッシュにhypotonic bufferをかけ５min放置。 スクレーパーではがし、遠心。 上澄みを細胞質画分。 ペレットにhigh-salt bufferをいれ、ボルテックス。 遠心し上澄みを核画分としています。 よろしくお願いします。

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