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(無題) 削除/引用 No.1118-11 - 2008/05/13 (火) 18:31:36 - aaakkk123 > テキストで40kDaと書いてあったということですか。 そうなんです。 > 細胞を染めるにしても、異常な合成経路でその後膜に親和性があるため、そこに移行したことを否定できますか? > 折角作ったからというのはあるかも知れませんが、この辺の選択は重要なので、もう一度慎重に考えてください。 簡単にタグをはずせるようなの（TAKARAの製品）で、タグをはずしたコンストラクトを作製します。 > あきらめて別のコンストラクトを作ることをおすすめします。特異的抗体でいいものが見つかるのであればTAGは考えなくて良いのではないでしょうか。 いい抗体が無いのですが、タグをはずして、PCRなどで入っていることを確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.1118-10 - 2008/05/13 (火) 00:04:25 - おお >[Re:9] aaakkk123さんは書きました : > > で、その論文のSDSPAGEでのサイズが40KDaですか? > バンドのだけしか出ていませんでしたが、40kDaなんですよ。。 テキストで40kDaと書いてあったということですか。 > > おおさんやTさんのアドバイスであるように、 > 一度、低温でソニケーションをするなど、高熱処理を避けたサンプル調整を行ってみます。 > 同時に、免染で膜表面に来ているかを見てみます。 > それでもだめなら、タグをC末か、つけずに受容体だけにしたベクターを作製してみます。 今のコンストラクトでは書かれている実験が無駄になる可能性が高いと思います。発表するにしても、N末にシグナルシーケンスが予測されるならそれが使われていない事、そうした場合はその膜移行のメカニズムなどと、納得行く実験、考察を示さないとパブリッシュ出来なくなる可能性があります。仮にうまくいっていても全て後手に回ってしまうような印象です。 細胞を染めるにしても、異常な合成経路でその後膜に親和性があるため、そこに移行したことを否定できますか? 折角作ったからというのはあるかも知れませんが、この辺の選択は重要なので、もう一度慎重に考えてください。 あきらめて別のコンストラクトを作ることをおすすめします。特異的抗体でいいものが見つかるのであればTAGは考えなくて良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1118-9 - 2008/05/12 (月) 19:35:20 - aaakkk123 > で、その論文のSDSPAGEでのサイズが40KDaですか? バンドのだけしか出ていませんでしたが、40kDaなんですよ。。 おおさんやTさんのアドバイスであるように、 一度、低温でソニケーションをするなど、高熱処理を避けたサンプル調整を行ってみます。 同時に、免染で膜表面に来ているかを見てみます。 それでもだめなら、タグをC末か、つけずに受容体だけにしたベクターを作製してみます。 結果が出次第、このトピックに書き込みます。

(無題) 削除/引用 No.1118-8 - 2008/05/12 (月) 18:40:07 - おお >[Re:6] Ｔさんは書きました : > ここでも時々出ていますが、膜貫通領域を多数持つ蛋白の場合、SDS-PAGE サンプルを通常のように９０数度で加熱すると、凝集して見かけの分子量が非常に大きくなる事があります。 そうそうこれ言うのわすれてました。膜タンパク、疏水性のつよいたんぱく質はたまにSDSPAGEサンプルバッファーで過熱後あグッてしまうののがありますね。低い温度でしょりする(60度以下)とか、低温のためジスルフィド結合の切り残しを気にする人はDTTとかもう少し強い還元剤を使う人もいます。サンプルバッファー、ゲルに6Mぐらいのウレアを入れて改善されているれいもあります。 >[Re:5] aaakkk123さんは書きました : > その可能性はあるとは思いますが、同じ受容体を過剰発現させた論文があるので・・・。 で、その論文のSDSPAGEでのサイズが40KDaですか? > > > >[Re:3] GSTさんは書きました : > C末にタグをつけたほうがいいのでしょうか？ > 基本的な質問で申し訳ないのですが、 > 教えてください。 > よろしくお願いします。 私のコメントも見てください。一概にC末がいいと言うのは乱暴ですが、N末は避けたい状況だというのが分かると思います。 非常に疎水性がつよいため、従来ER膜上で作られるものが、サイトゾルで作られて、その後膜親和性により、膜に結合しているケースも考えられますが、この場合は機能できるようにフォールディングされているか、修飾されているか疑問ですね。そういう状態なのでタンパク同市つよくアグリゲートして、SDSPAGEで高いサイズに来ているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1118-7 - 2008/05/12 (月) 17:56:53 - Ｔ 読み直してみると、 > 遺伝子のコーディング領域のすぐ前にHAタグを入れています。 なんですね。 これでは膜表面に行く方がむしろ不思議だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1118-6 - 2008/05/12 (月) 17:55:30 - Ｔ ここでも時々出ていますが、膜貫通領域を多数持つ蛋白の場合、SDS-PAGE サンプルを通常のように９０数度で加熱すると、凝集して見かけの分子量が非常に大きくなる事があります。加熱せずに室温でしばらく放置とか、低温でソニケーションをかけるとかすると効率よくモノマーが見える場合があります。私が手がけている GPCR は、それでもやはりある程度ダイマーのバンドが見えます。 また、Ｎ末タグが働くか働かないかはケースバイケースです。全く同じ位置にタグを入れてもタグの種類によって表面に出たり出なかったりもします。ある蛋白で表面に出なかったタグも別の蛋白では効率よく表面に出たりして、あまり一定の法則は見当たりません。単純に細胞のライセートで蛋白の発現を見ているだけだと、表面には出ていない可能性もかなり高いです。膜透過処理していない細胞をタグ抗体で染めてみて、確かに染まることを確認する必要があると思います。Ｃ末にタグを入れた方が膜表面に発現する可能性は高いです（これも１００％ではないですが）。

(無題) 削除/引用 No.1118-5 - 2008/05/12 (月) 17:11:01 - aaakkk123 早速のコメントありがとうございます。 >[Re:2] ぷうたんさんは書きました : > 多量体を形成しているという可能性はないのでしょうか。 > あるいは細胞内で非生理的な結合が起こってしまっている等… その可能性はあるとは思いますが、同じ受容体を過剰発現させた論文があるので・・・。 >[Re:3] GSTさんは書きました : > 遺伝子のＮ末端とありますが、シグナル配列の下流に入れてますか？ 遺伝子のコーディング領域のすぐ前にHAタグを入れています。 このような状態では、膜移行性が失われてしまうってことでしょうか？ C末にタグをつけたほうがいいのでしょうか？ 基本的な質問で申し訳ないのですが、 教えてください。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1118-4 - 2008/05/12 (月) 17:06:41 - おお まずはタグがN末でよかったか、確認してください。膜タンパクは大抵(すべてではない)N末にシグナルシーケンスがついていて、それを介してER膜上で合成されるようになってます。ウエスタンはネガコンが取れますよね。ですから、ノンスペかどうかはちゃんと確定できるのではないでしょうか?それとも、ネガコンでもそこにバンドがあるのでしょうか。 >膜蛋白には時々みられる 膜タンパクでなくても、アミノ酸からの推定分子量と実際のSDSPAGEの移動度にかなりさがある事はあります。とくに膜タンパクのばあい、糖鎖修飾のため、大きく高分子量にシフトすることがあります。そのタンパクはについて、すでに発表されたデーター(特にウエスタンとか)とかないですか? >多量体を形成しているという可能性はないのでしょうか。 この可能性はそんなに高くないと思います。SDSPAGEで大抵のコンプレックスは壊されますから。完全には否定しませんが、慎重に判断した方がいいです。 >予定では，約40kDa これはアミノ酸からの推定分子量からきてますか?それとも何か文献のデーターからですか?あるいは両方で一致しているとか。

(無題) 削除/引用 No.1118-3 - 2008/05/12 (月) 16:29:34 - GST 遺伝子のＮ末端とありますが、シグナル配列の下流に入れてますか？

(無題) 削除/引用 No.1118-2 - 2008/05/12 (月) 16:27:05 - ぷうたん 多量体を形成しているという可能性はないのでしょうか。 あるいは細胞内で非生理的な結合が起こってしまっている等…

GPCRのトランスフェクション 削除/引用 No.1118-1 - 2008/05/12 (月) 14:48:05 - aaakkk123 7回膜貫通型の受容体の遺伝子のN末にHAタグを付けて神経系の細胞にトランスフェクションしウエスタンを行ったところバンドが予期せぬ位置に出ました．　 予定では，約40kDaですが，200kD以上ありそうです．　 問題の200kD以上ありそうなバンドは，かなり強いのでノンスペバンドとは思えないのですが，，， 　膜蛋白には時々みられるという情報もあり，同様な経験があればアドバイスを頂けますか．

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