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(無題) 削除/引用 No.1115-5 - 2008/05/12 (月) 13:09:40 - am おおさん　ありがとうございます。 末端に4残基ついていてもそんなに切れにくいんですね。 プライマーを発注したので、 そのままSal�Tにかけるものと、ＴＡクローニングを行うものと2通りでライゲーションを試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1115-4 - 2008/05/12 (月) 10:08:05 - おお 個人的にはSal IはPCRフラグメント末端につけたくないですね。片側4塩基延長しても2時間の処理で10%ぐらいしか切れませんし。ただしそれでもやられる方はいるようですが。どうしてもという時は確かに１度ブラントかTAでクローニングベクターにほりこんでから切出しでも良いと思います(安全策として、直接ほりこむのと同時にやればいいかと思います)。SalIを使うとして私ならプライマーは30前後にして、真ん中あたりにミスマッチの状態でもいいから配列をおくかもしれません。 PCRの末端は、切れないことがある程度想定されますので、末端が燐酸化されたプラグメント(燐酸化したプライマーでPCRするかPCR後燐酸化、末端は平滑であることが必要)をライゲーションし、フランメントが直鎖状につながったコンカテマーを作成しそれから切るというのも選択肢です。

(無題) 削除/引用 No.1115-3 - 2008/05/11 (日) 23:13:03 - am ありがとうございます。 この情報をもとにプライマーを設計しようと思います。 初心者なもので、つまらない質問すみませんでした。 お答えいただき感謝します。

NEBのサイトに情報がある 削除/引用 No.1115-2 - 2008/05/11 (日) 22:33:32 - あべちゃん 下記サイトの中にお探しの情報が詳しく載っています。 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/default.asp このサイトを参考にし、制限酵素の認識部位と末端との距離を配慮すれば、TAクローニングなどは不要かと思います。

インサートのSal�Tsite 削除/引用 No.1115-1 - 2008/05/11 (日) 22:29:54 - am 既存のトピックの中で、 『Sal�Tサイトが比較的末端にあると切れにくい』 という記述を度々見かけるのですが、 目安としてSal�Tの外側にどれくらいの長さが必要でしょうか？ 現在、insertの配列をPCRで増やす際に、プライマーにSal�Tサイトを付け加えることで、vectorに組み込もうとしているのですが。 その場合はinsertを一度ＴＡクローニングする必要があるということでしょうか？

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