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(無題) 削除/引用 No.1112-22 - 2008/05/15 (木) 10:33:17 - おお ゲルが分厚いのかなぁとも思いました。私の感覚では5mmでちょっと薄いなと思うけど、1ゲルが分厚いのかなぁとも思いました。私の感覚では5mmでちょっと薄いなと思うけど、10mmじゃちょっとぶ厚くねぇという感じに思ってます。 特にアガロースが濃いですから、UVを妨げるのと、エチブロの浸透が遅くなるのとで見にくかったのかなあと。。。 UVで見てる時、端がピンクが濃くって、ピンクの縁とか出来てませんでした?それだとゲル内部にエチブロが浸透しきってない状況です。0mmじゃちょっとぶ厚くねぇという感じに思ってます。

(無題) 削除/引用 No.1112-21 - 2008/05/14 (水) 17:55:58 - ~ マーカーのバンド(数十ng?)は見えるけれども、 それよりも薄い目的のバンド(数ng以上?)が見えないという 絶妙な染まり具合だったのでしょうね。 マーカーのバンドが見えていた以上、 プラスミド量さえ増やせば、エチブロの条件は変えなくてもうまくいったのだと思います。 気になるのは、このプラスミドは既にシークエンシング済みなのでしょうか？ このサンプルが、ご自分でPCRされて、シングルコロニーを拾ってミニプレップしたサンプルだとすると、 クローニングベクター3kbとすると、 10ng(マーカーより薄い濃度)のインサート120bpを含むベクターは約260ngで、 260/9=30ng/uL位ですよね。 ABI BigDye Terminator キットでの推奨濃度200ng/uLにはかなり薄い濃度だと思いますが、 何か、希薄サンプル用のシークエンシング法があるのでしょうか。 制限酵素の切断効率が悪くて、1/6以下しか切れなかっただけかもしれませんが、 シークエンシングがまだで、4ピースライゲーションした後で変異が見つかると、とても悲しい気持ちになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1112-20 - 2008/05/14 (水) 16:44:19 - 機種依存文字使わないで@AP >10倍に濃くしました。 その後の実験でバンドが見えるようになったので、 エチブロが薄かったこともバンドが見えなかった 要因の一つだったと思います。 それだ!! >私は後染めで実験をしていますが、 うちの研究室のエチブロの濃度は1.0mg/L です。 標準的な濃度だと思いますが、ゲルの濃度によって染色が飽和する時間が違います。1% 以下のAgaroseなら10〜30分くらいで飽和しますが、短鎖用に2 %とか3%を使うと飽和しきるのに1時間以上かかったりします。DNAが十分量あれば完全に飽和し切らなくても見えますが、検出限界ぎりぎりだと十分に染色時間をとらないと見えません。かといって染色時間が長くなるとDNAが拡散してぼやけてきます。EtBr濃度を上げれば飽和にかかる時間を短縮できますから（バックグランドはあがるけど）短時間で十分に染色できて、検出できたというのが勝因でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1112-19 - 2008/05/14 (水) 16:29:35 - おお > 私は後染めで実験をしていますが、 > うちの研究室のエチブロの濃度は1.0mg/L です。 > 教授に実験の相談をした時に、エチブロの濃度が薄すぎると言われて > 10倍に濃くしました。 原因が分かったような気がします。エチブロが失活しているか、もとの濃度が間違えているか、染色が十分でないかではないかと思います。10mg/Lは濃すぎます。標準のプロトコールは0.5mg/Lです(10 mg/mLを2万倍希釈と覚えています,この状態でよく見ればほのかに赤いなという感じです)。たぶんエチブロが薄すぎるといったのは、バックグラントやマーカーの染まり具合からそう思ったのだと思いますので、やはり失活とか染色不足ではないかとおもいます。10mg/Lいれると、DNAのないところもUVでぴんくに可也強く光り出すので逆に検出しにくいと思います。従来の濃度でも結構光っているのが肉眼でわかります。

(無題) 削除/引用 No.1112-18 - 2008/05/14 (水) 16:05:24 - じゅんこ リットルの表記が文字化けしたということで すみませんでした。 機種依存文字という言葉、初めて聞きました。 今後使わないように調べて、以後気を付けます。 プラスミドの量を増やしたことが、 切り出せたことの大きな要因だったように思います。 濃度の測定はしていないのですが、 TOTAL 20uLのうち、プラスミドを9uL使用したら バンドをちゃんと確認することができました。 私は後染めで実験をしていますが、 うちの研究室のエチブロの濃度は1.0mg/L です。 教授に実験の相談をした時に、エチブロの濃度が薄すぎると言われて 10倍に濃くしました。 その後の実験でバンドが見えるようになったので、 エチブロが薄かったこともバンドが見えなかった 要因の一つだったと思います。

(無題) 削除/引用 No.1112-17 - 2008/05/14 (水) 15:18:12 - 機種依存文字使わないで@AP >> 紛らわしいので、Lを使うのがインターネット時代にマッチしています。 >へぇ!こんなネチケがあったんですか、、、私も参考にします。 ネチケというより、豆知識ですが、、、 当方、ただいまMac OSX, Firefoxで見ているのですが、 じゅんこさんの書いた「TOTAL 20μℓ」で マイクロは全角でしょうか、これは読めます。 そのあとの「ℓ」はひょっとして、全角小文字l（エル）筆記体のリットルでしょうか。読めません。 ちなみに小文字エル筆記体のリットルは、いまだに算数の教科書で教えているようで、それがすり込まれている人も多いようです。しかし、記憶が正しければ、それはIUPACでは使わないように勧告していて、小文字ローマンの「l」を標準表記と定め、代替表記として「L」も認めるということになっていたと思います。代替表記としてLを残したのはインターネット時代に対応するためじゃないかなあと想像しています。 じゅんこさんの 「Bgl�UとSal�T」 で、全角ローマ数字IIとIも、rの上付文字と句点に見えます。 ローマ数字は半角のI（アイ）、V（ブイ）、X（エックス）を並べるか、 いっそアラビア数字で、Bgl2, Hind3, EcoR5のようにしてもらえると間違いないです(EcoO109Iなんかでこれやると、またわかりにくくなりますが、ケースバイケースで）。

(無題) 削除/引用 No.1112-16 - 2008/05/14 (水) 14:32:51 - おお >[Re:15] 機種依存文字使わないで@APさんは書きました : > 文字化けして正確に読めないのですが、 > 失敗したとき、20 uL中8 uLのプラスミドだったのを9 uLにしたら見えたといっているのでしょうか。 わたしも、そう思ったのですが、とりあえず突っ込みませんでした。 ま、今回に限ってはうまくいっているようですし、とりあえずは、よかったですねということで。 でもDNA量は少量取ってキュベットに入れるだけなので、測りましょうよ。 > リットルも受け手側のフォントによっては、1 (いち）やI（アイ）と紛らわし > いので、Lを使うのがインターネット時代にマッチしています。 へぇ!こんなネチケがあったんですか、、、私も参考にします。

(無題) 削除/引用 No.1112-15 - 2008/05/14 (水) 13:23:58 - 機種依存文字使わないで@AP 文字化けして正確に読めないのですが、 失敗したとき、20 uL中8 uLのプラスミドだったのを9 uLにしたら見えたといっているのでしょうか。 1 uLに違いで見えなかったものが急に見えるようになったとは思えないのですが。 で、ひょっとすると根本的な原因は染色不足だったのではないかなあと。 ゲルにEtBrを入れてバッファーには入れないと、EtBrが陰極側に抜けていくので、低分子側から染色が弱くなります。このケースではないですか。 見えたときには泳動が短めで、EtBrが抜けきっていなかったとか、何回か泳動しガルから溶出したEtBrが十分、泳動バッファーに含まれていたとか。 こういうトラブルを避けるためには、バッファーにもEtBrを入れておくか、後染めにした方がいいでしょう。 それと、機種依存文字は使わないでください。 まる1、まる2とか、全角一文字の単位(マイクロリットルとかセンチメートルとか）、全角一文字のローマ数字など、MacとWindowsで互換性がなくて意味不明な文字列になってしまいます。 また、シンボル、ギリシャ文字は、受け手側のブラウザでそれだけフォントを変えるということをしてくれないので、対応するアルファベットになります（たとえばマイクロがミリに）。マイクロはmicroと綴るか、uで代用してください。リットルも受け手側のフォントによっては、1 (いち）やI（アイ）と紛らわしいので、Lを使うのがインターネット時代にマッチしています。

(無題) 削除/引用 No.1112-13 - 2008/05/13 (火) 16:15:28 - ~ 何を改善して、切り出すことができるようになったのですか？ キーになったと思われる改善点を書いておくと、今後同じ現象が起きて困った人の役に立つと思います。

(無題) 削除/引用 No.1112-12 - 2008/05/13 (火) 16:03:17 - じゅんこ HB101の間違いでした。

皆さんありがとうございます。 削除/引用 No.1112-11 - 2008/05/13 (火) 16:01:57 - じゅんこ ようやく120bpのバンドを切り出すことができました！！ 皆さんのメッセージ、非常に勉強になり、参考になりました。 今、4ピースのライゲーションを済ませ、BH101で形質転換中です。 うまくいきますように…。

(無題) 削除/引用 No.1112-10 - 2008/05/13 (火) 15:44:23 - A 私の以前いたラボではこれほど短い断片を切り出す場合は アガロースではなくアクリルアミドゲルを使っていました。 はっきりとした理由はわかりませんがなんとなくアクリル アミドゲルのほうが短い断片を分離しやすい為だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1112-9 - 2008/05/12 (月) 14:09:58 - 試薬 本題とはずれますけど、４ピースのライゲーションで時間がかかっているようでしたら、４断片を連結して一つの断片につなげるようにPCRを工夫してみてはどうですか？ PCRプライマーの末端配列が重複するように設計しておいて、４つの断片をそれぞれを増幅させた後、それらの断片を混ぜて、最も両端のプライマーでPCRし直すと４つが連結されたフラグメントが増幅されてきます。 文章で書くとわかりにくいのですが、ミューテーションを入れたりするときに使う方法です。

(無題) 削除/引用 No.1112-8 - 2008/05/12 (月) 06:50:28 - おお > ＞3.プラスミドが切れる条件で切っていますか？ > TEに溶かしているので、EDTAの持ち込みがあるのかもしれません。 > バッファーと制限酵素の組み合わせは合っていると思うのですが･･･。 > Hバッファーを用いて、Bgl�UとSal�Tで同時に処理しています。 EDTAの持ち込みはさほど問題はない場合がおおいいです。一般にTEは1mMのEDTAが入っています。しかし制限酵素用バッファーには1xで10mMのMgCl入っていますので、EDTAに対して大過剰ですから、問題はないと思います。制限酵素をうたがうなら同時に切るの一緒に、一つだけの酵素の処理も一緒にやってこれらは2%でなく1%ぐらいのアガロースで流せばいいかと思います。切り出すには2%以上を使えばいいです。 あるいは、バッファーは両方Hでいいのですが、わざとひとつづつやる手もあるかなと思います。例えば処理したい量半分にし一方をBglIIもう一方を SalIで切り、切れ具合を確かめると、両者の酵素が実際効いているか察しがつくと思います、その後両方にもう一方の酵素を加えると完全な消化ができる条件ので切っていると言う確信のうえで処理ができるのではと思います。 DNAの純度は確かに酵素の活性に影響することがあります。でも今はたいていのひとがミニプレップキッと使ってるのではと思ってさほど心配するに及ばないと思います。キットを使ってなく、いつもよく切れる制限酵素の切れがいまいちであればフェノール続いてクロロフォルムの処理し、エタチンごTEでリカバーすればたいていの場合OKです。 キットを使ってDNAのクオリティーが問題になるのは、アルコールの持ち込みです。溶出の前のウォッシュでえターノールを使いますから。キットのその条件を守っていればたいてい問題はでませんが、、、気になるならエタチンしてリカバーすれば良いでしょう。 Hバッファー(高い塩濃度)のバッファーなので若干移動度が遅く130bpsでしたら、150とか少しうえにバンドがくるかもしれません。 プラスミドを疑わないといけないということはないことを祈ってます。

(無題) 削除/引用 No.1112-7 - 2008/05/12 (月) 01:05:57 - AP ＞3.プラスミドが切れる条件で切っていますか？ TEに溶かしているので、EDTAの持ち込みがあるのかもしれません。 バッファーと制限酵素の組み合わせは合っていると思うのですが･･･。 Hバッファーを用いて、Bgl�UとSal�Tで同時に処理しています。 少なくとも制限酵素消化なら、10x bufferと制限酵素以外のすべての体積をDNAのTE溶液で占めても平気ですよ（例えば10x buff 2uL, enzyme 2 uL, DNA in TE 16 uLとか）。卒業研究を始めてから半年くらい、そうやってたことがあったのですが、問題が起こらなかったので間違いに気がつきませんでした。 もし、不完全消化のため100 bpが見えないなら、見えているバンドも本来のサイズ+ 100 bpのような変なサイズが混じるはずです。見えているバンドが予想されるサイズのみで、おかしなサイズが出ていないならちゃんと消化できているということですね。 小さいサイズが見えないなら単純に量を増やせばいいと思いますよ。 一定量のプラスミドを消化してできるバンドはすべて等モルDNA断片ですから、重量比はDNA鎖長の比になります。ぎりぎり見えていた200 bpが2 ngとすると、見えなかった100 bpは1 ng。単純にインプットのプラスミドを倍にすれば100 bpは2 ngで見えるようになります。 私だったら、そんなぎりぎりの線で実験をデザインせず、プラスミド量をもう1桁から2桁くらい多く消化し、エタノール沈殿で濃縮して泳動にかけます。

(無題) 削除/引用 No.1112-6 - 2008/05/11 (日) 23:48:37 - じゅんこ ＞1.100bpを検出できる系で見ていますか？ ２%アガロースで、100bpをカバーできるマーカーも一緒に流して、 泳動しています。 マーカーの100bpのバンドは、ハッキリと確認できます。 ＞2.DNA量は適正ですか？ インサート量は、正確に測ったことはありません。 測ってみます。 ＞3.プラスミドが切れる条件で切っていますか？ TEに溶かしているので、EDTAの持ち込みがあるのかもしれません。 バッファーと制限酵素の組み合わせは合っていると思うのですが･･･。 Hバッファーを用いて、Bgl�UとSal�Tで同時に処理しています。

基本的に問題ないと思います 削除/引用 No.1112-5 - 2008/05/11 (日) 22:31:03 - あべちゃん ３ピースライゲーションまでなら、ちょくちょくしますが、問題ないと思います。その際、制限酵素のコヒーシブ・エンドの配列が異なるように調節するのが唯一のこつだと、自分では思っています。 あと、このサイトで何度か提案してその都度、多くの方々には受け入れてもらえないのですが、私はベクター・コンストラクションの際、一切、ゲルからの切り出しをしません。特に、断片が小さい場合、同じモル数存在しても、塩基数で少ない分、じゅんこさんの仰るように目的断片が見えづらいという問題があります。 私が普段行っている方法を簡単に申しますと、 ベクター側とインサート側のプラスミド（やDNA断片）を目的の制限酵素で処理します。 次に、制限酵素で消化したDNAを精製します（制限酵素を除去し溶液をTEにするため；TEはTAKARA ligation kitのligase活性を阻害しない）。 ベクター側とインサート側のプラスミド消化物を混合します。（その際、おおよそ等モルになるように） ４５度で５分ほどインキュベート後、オンアイスで数分放置し、余熱を除去。 TAKARA ligation kitなどでライゲーション。 最後に、形質転換します。 ベクター側とインサート側のプラスミドが持つ薬剤耐性遺伝子が異なれば、かなりの確率で目的のプラスミドを得ることができますが、仮にアンピシリン同士であっても、８クローンくらい拾えば１−２個は獲得できます。

(無題) 削除/引用 No.1112-4 - 2008/05/11 (日) 20:46:23 - ~ 使用目的が4ピースライゲーションであることは、今回の問題にとって特に重要な問題ではないような気がします。 それよりも、ベクターや制限酵素についての情報があったほうが、 問題解決に近づくと思います。 当たり前すぎて確認済みの部分も多いかと思いますが 1.100bpを検出できる系で見ていますか？ 1%アガロースで、200bpが見えたから100bpも見えるだろうと考えたりしていませんか？ ちゃんと100bpをカバーできるマーカーも一緒に流して、マーカーが見える条件で泳動していますか？ 2.DNA量は適正ですか？ たとえばTベクター(3kb)に100bpのインサートが入っている場合、 3.1ugのベクターからインサートを切り出すと、 3ugのTベクター部分と、100ngのインサート部分になります。 今回の切り出しているインサート量は、検出できる量(マーカーで見れている量)の何倍なのですか？ 3.プラスミドが切れる条件で切っていますか？ 私なら、20uL中8uLも持ち込む場合は、PEG沈殿で精製してもまだ不安です。 こんなに持ち込んでも、制限酵素がちゃんと働くくらいきれいなプラスミドなのですか？ TEに溶かしているとすると、EDTAの持ち込みは大丈夫なのですか？ また、バッファーと制限酵素の組み合わせはあっていますか？ 簡単に確認する方法として、 まずは今回切ったインサート入りベクターのベクター部分は、すべて、理論上の切れた位置に来ていて、切れ残りの位置にプラスミドはまったく見えない状態ですか？ また、同じプラスミド量、同じバッファーで制限酵素を片方ずつ入れた場合、 それぞれの酵素はちゃんと切れますか？ 私なら、Teasyベクターに入っているとすると 20~100mL位で培養 アルカリSDS法でイソプロ沈まで行う 500uL位に溶かしてRNase処理 PEG沈殿 PCI、CIA抽出 エタ沈 TEに溶かす(1ug/uL以上の濃度にする) 20uLのボリュームで3ug程度を切る(可能であれば、double digestionで切る) 6%PAGEゲル(既製品)か、3%アガロースで流して切り出し で行います。

(無題) 削除/引用 No.1112-3 - 2008/05/11 (日) 16:56:39 - おお > 本題とはそれますが、3ピースのライゲーションですか、、、 あ、4ピースですね。難しそうです、、、、

(無題) 削除/引用 No.1112-2 - 2008/05/11 (日) 16:40:08 - おお >[Re:1] じゅんこさんは書きました : > 制限酵素処理したトータル20μの内、プラスミドは8μ使用していますが、 単位が書いてないので、、、、、 > > 単純に制限酵素処理に用いるプラスミドの量を増やせば、 > 解決できることなのでしょうか？ 100bpsぐらいなら何とかなると思います。何で検出しているかで違ってくると思いますが、エチブロだと数ngが検出限界です。UVを長波長側にすると少し検出限界は下がるでしょうけど、30ng程度あれば何とかなると思います。例えば、クローニングベクター4kbpsに入っているとして、30ngぐらい100bps断片をえたいなら40倍(4000/100)量の制限処理をしたプラスミドを使えばいいかと思います。1.2ugですね(SYBR® Greenとか使うともう少し感度が上がるとおもいます)。不安なら5ugぐらい使っても良いかと思います。電気えいどうは大きいコームをつかい、UVの影響が気になる時はレーンの3/4をアルミホイルでカバーしシグナルの見えた場所のレーン全体を切り出せばいいかと思います。 ミューピッドの6m幅のコームでも10ugぐらいのっけっても切出しする程度ならOKです。 注)ug=マイクログラム アガロースは少なくとも2%、2.5-3%ぐらいでしょうか 本題とはそれますが、3ピースのライゲーションですか、、、

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