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(無題) 削除/引用 No.1107-5 - 2008/05/10 (土) 15:27:48 - 名無しさん 検量線はすごい大事。検量線は（特にブラッドフォールド法の時は）毎回書いてそれで計算した方がいいというかこれはすべきとみんな言ってる。何でかというとブラッドフォールド法だと、試薬が古くなってくると検量線の勾配がだんだん緩くなってくるしそれでかどうか分からないけど直線性のある範囲が狭くなってくる感じがするから。検量線書いた時とサンプルを定量した時が1~2週間とかなら、そんな問題になるほどズレないかもしれないけど、１ヶ月とか間があくとこれはけっこう影響すると思う。 挙げている数字は心配するほどそんなに大きなズレとは思えないというか、慣れた人でも忙しくてちょっとラフにやったりするとこのくらいのズレは起きる。上に書いたようなことつまり本質的な部分で問題点がないことを確認した上で、もしあまり神経を使うことなく、かつもっと安定した値を出したいなら、nを増やせばいいとおもう。ただ蛋白質濃度がすごいクリティカルに響いてくるような実験でなければあまりここにサンプルと時間を使うのもどうかなあとも思う。 それと測定するサンプルが３０だとか５０とか100とかみたくあんまり多いと、はじめの方で測ったのと後の方で測ったのでインキュベーション時間の差が無視できなくなることがあると思う。プレートリーダーだと大丈夫かもしれないけど、キュベットだとそういう問題が起きるかもしれない。

コンパチブル 削除/引用 No.1107-4 - 2008/05/10 (土) 13:42:48 - あべちゃん BioRad Protein Assayを含め、色々な蛋白質定量方法にはそれぞれ、一長一短があり、サンプルに含まれる色々なものの許容濃度には注意した方が良いです。 上記のものもDCとかRC Assayという姉妹品もあり、それぞれ界面活性剤や還元剤に対するコンパチビリティが違います。 あと、おおさんも仰っていますが、サンプルも希釈系列を取り、スタンダードの線形性が保たれた吸光度の範囲内を用いて、サンプルもその吸光度内に収まる範囲のデータを用いるべきだと思います。 定量性が大切な実験の場合、大変面倒ですが、 私は９６ウェルに対して、サンプルは全て８段階の２倍希釈系列とし、吸光度を測定後、スタンダードの範囲内に含まれるデータを用い、その吸光度と希釈率から最小自乗をとり、R自乗が0.95以内である事を確認し、定量してます。 ただし定性的な実験の場合、この限りではありません。

(無題) 削除/引用 No.1107-3 - 2008/05/10 (土) 12:25:18 - おお ブラッドフォードでしょうか。毎回スタンダードを入れているでしょうか。確かバイオラッドのフォトミーターを使えば、スタンダードを一度取ればセイブ出来るので、セイブしたスタンダードで毎回測ることも可能です。 多分お気づきだと思いますが10個ほどサンプルがあって、全部測ってから最初のものを測り直すと幾らかずれています。 で言いたいことは、毎回正確に何分後に測ると決めていても何処まで忠実にできるだろうかとか思ったりするわけです。実際スタンダードを毎回入れるのは当たり前なのですが、セイブできたりとかで簡略かできるのと、サンプル間の相対的濃度が重要な時と絶対的濃度が必要な時と一緒ごたにしている人がいてセイブしたものをいつも使っている人もいますし、ひどい時には違うバッファー系のスタンダードを充てる人もいたりします。 お示しの値はタンパク量でしょうか、OD値でしょうか?OD値であれば振り切れています。実測値は1以下にする方がいいかと思います。私はサンプルもなるべく希釈系列を作るようにしてます(正確な値が欲しい時、またはサンプル間の濃度のばらつきがおおきいとき)で、希釈系列にフィットする値が出ているところでサンプルの濃度を決めることがあります。スタンダードも一度細かく取って何処まで直線性が保たれているか確認するのがいいかもしれません。多少直線性がなくてもそれにフィットする曲線を書いて濃度を求めることも可能ですが、そういう所では誤差が大きくなってしまいます。 特にソフトが勝手にやってくれる便利すぎる時代になってますので、注意した方がいいのかなと思います。 あとは何から何まで微量(ひと桁のマイクロリットル単位)でやってしまうというプロトコールが多くなってきています。ピペッティングのエラーを考えると必要以上に小さい値でやるのもどうかと思うわけです。たぶんn=2以上でやっていらっしゃるようなので、そういう所でエラーがあるならお気付きかもしれません。 それと違うピペットマンを使うと違う値が出たりと言うのも場合によってはあると思います。マイピペットマンを持っておきたいものです。

(無題) 削除/引用 No.1107-2 - 2008/05/09 (金) 19:02:54 - A 予想されるおおもとのサンプルの蛋白質量はどれぐらいですか？ もしかなり濃いのであればピペッティング時に例えばチップの 外側に付いた蛋白質が誤差を生んでいるのかもしれません。 少ない量、または濃いサンプルを扱う場合、私は5uL未満は取らない ようにしています。もしサンプルが十分量あるのであれば10uL未満です。 もしそれ無理であればチップが液面に触れる程度しかチップをサンプルに 付けないようにする必要があります。この辺りの説明については お使いのピペッターのマニュアルに詳しく書かれていますからそちらで 確認してください。

蛋白定量 削除/引用 No.1107-1 - 2008/05/09 (金) 18:18:54 - 小児科医師（ゆとり教育） Bioradのprotein assayを用いて蛋白定量を行っています。 しかし、毎回微妙に結果が異なってしまいます。 1回目 サンプル１　1.8242455 サンプル２　2.388365 サンプル３　3.100937　　← 2回目 サンプル１　1.9650125 サンプル２　2.416975 サンプル３　2.7226375　　← そんなに大きな差ではないですし、人間のやることなので 毎回同じ結果にはならないと思いますが、←のサンプルは 1回目と2回目で随分と結果が異なってしまいます。 できる限り差が出ないようにピペッティングに気をつけたり 唾液が混入しないようにマスク、手の脂が入らないように 手袋をしたりしています。また各サンプルはn=2〜4にして います。 皆さんが蛋白定量を行っている時に気をつけていることが あれば教えてください。

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