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(無題) 削除/引用 No.1102-10 - 2008/05/09 (金) 11:08:14 - tom アドバイスありがとうございます。 今回発現誘導した抗原は、N末から３０aaの場所にシステインを１つ含んでいます。還元、非還元を比較したことはありませんが、2-MEを用いた再試験の時に、非還元のサンプルも作製し確認してみようと思います。 また、この120aaを15aaずつ（５aaオーバーラップ)にして検討を行いましたが、この時はウエスタンブロットのシグナルがポジコンとして泳動した120aaしか得られませんでした。 まずは、還元が不十分でシグナルが得られていない可能性を確かめてみようと思います。 また、何かアイデアがありましたら教えてください。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1102-9 - 2008/05/09 (金) 10:40:08 - 中年 短くした抗原分子も同程度に発現していることは確認していますか。 ローカルな高次構造で抗原がマスクされている可能性もあると思いますので、さらに短く削り込んでみられたことがありますか。

(無題) 削除/引用 No.1102-8 - 2008/05/09 (金) 10:36:41 - よっしー 一般的に抗体分子は，長くてもせいぜい十数アミノ酸残基を認識すると思います．120アミノ酸残基というのはちょっと考えられません． しかしながら，抗体分子は3次構造を認識しますので， 120アミノ酸残基離れたアミノ酸同士が，3次構造上隣接することはありえます． ですから，還元剤で直鎖状にしましたかとお尋ねしたしだいです． ウエスタンブロットで使える抗体は，たまたま一次構造で連なったアミノ酸を 認識する抗体だと思います． 今回の場合，還元剤で処理していないタンパク質と，処理したタンパク質とを比較すると，シグナルが減少したりしませんか？ そもそも，発現させたタンパク質中にシステインは含まれますか？ そのあたりで，糸口が見つかるかもしれません．

(無題) 削除/引用 No.1102-7 - 2008/05/09 (金) 00:12:20 - tom 確かに糖鎖の問題もあるかもしれませんね。ベクターは同時にシーケンスを読んで、まず間違いないと思っています。ただ、たんぱく質発現量に若干差が見られるので、その点は技術を向上させるしかないかなと思っています。お二人の方に２-MEでの還元を勧められるということは、やはり還元剤が重要と言うことですね。早速確かめてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1102-6 - 2008/05/08 (木) 22:50:56 - tom アドバイスありがとうございます。やはり長いエピトープをもっているという考え方が自然なんですね。サンプルバッファーは10mLぐらい調製して、分注後-80℃で保存しています。これもひょっとしてDTTに良くないでしょうか？その後、ヒートディネーチャー（95℃3分）してから泳動しています。2MEを使ってない理由は、上記のように多めに作製して分注保存するので、2MEはすぐに失活(蒸発）するのかなと思いDTTを選択していました。DTTが不安定であるとのアドバイスありがとうございました。これからは面倒くさがらずに要時調製を心がけようと思います。また、念のためもう一度発現誘導して、要時調製の2MEサンプルバッファーで確認してみたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1102-5 - 2008/05/08 (木) 22:49:36 - amits 還元剤か、糖鎖の問題？ 2-MEでしっかり還元してみる、あとはVectorが間違っている可能性･･･

(無題) 削除/引用 No.1102-4 - 2008/05/08 (木) 22:09:13 - sample buffer 実験結果が示しているように、そういう比較的大きな範囲がエピトープということではないのでしょうか。分子内ジスルフィド結合が残っているため、そうなるという可能性もあるかもしれませんが。 DTTは水溶液中では不安定でその還元作用はあまり長持ちしないと思います。DTT入りsample bufferは用事調製ですか。またDTTは加熱にも弱いと思いますが、加熱処理はしているのでしょうか。bMEを使わない理由はなんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1102-3 - 2008/05/08 (木) 20:23:52 - tom 早速の対応ありがとうございます。ウエスタンブロットの時は、還元剤としてＤＴＴを添加しています。現在得られている約１２０アミノ酸のＮ末Ｃ末どちらから１５アミノ酸削ってもシグナルが得られなくなります。大腸菌由来のたんぱく質の場合、還元剤の濃度を変えた方が良いでしょうか？現在、ＤＴＴ５％でサンプルバッファーを作製しています。

(無題) 削除/引用 No.1102-2 - 2008/05/08 (木) 19:58:53 - よっしー ウエスタンブロットをする際の電気泳動前に，還元剤で処理はしましたか？

抗体のエピトープマッピング 削除/引用 No.1102-1 - 2008/05/08 (木) 19:42:37 - tom 現在、研究室で独自に確立したモノクローナル抗体の エピトープを解析しています。 この抗体は、約520アミノ酸の分子をウエスタンブロットで認識できます。 各種primerを用いて、deletion mutantを作製し、 大腸菌にたんぱく質を発現誘導して ウエスタンブロット解析を行いましたが、 約120アミノ酸以下にエピトープを削ることができませんでした。 抗体がたんぱく質を認識するのに、このように長いエピトープが必要ということは、あり得るのでしょうか？ ちなみに、抗体はマウスに特殊な細胞を免役して得られたものです。 抗体のエピトープについて詳しい方がおられましたら、 是非とも御教授ください。 よろしくお願いします。

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