Bio Technical フォーラム

  • 書き込みがかなり増えてしまいサーバーの負荷が大きくなったので、新しいBioTechnicalフォーラムに移行してください。
  • 新しいトピックは新フォーラムでのみ立ち上げ可能です。レスは2009年2月15日までつけられますが、その後は、つけられません。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム（readのみ）　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

MACS 磁気細胞分離法について トピック削除
No.1092-TOPIC - 2008/05/07 (水) 14:42:43 - rokumaou
MACSがうまくいかなくて困っています。
マウスの肺胞上皮をisolationしようとしています。proteaseで肺を溶かし、CD45陽性の細胞を分離しようとしたのですが、あまり（というかほとんど）、分離されていません。
使用した抗体はe-bioscienceのmonoclonal抗体です。
考えられる点として、抗体の濃度（論文には1.5ug/million cellとの高濃度と書いてあるのですが、あまりにも濃いので、添付文章どうり（0.5ug/cell)にやりました。
もう一点ですが、MACSでソートするときにbufferをPBSでやってしまいました（説明書には、labeling buffer PBS with 2mM EDTA、BSA freeと書いてありますが気にせず、PBSでやりました）

印象として、抗体が機能していないと考えています。濃度のせいなのか、抗体が悪い？polyclonalのほうがいいのでしょうか？
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.1092-8 - 2008/05/09 (金) 15:15:44 - rokumaou
いろいろとありがとうございます。

>rokumaouさんの実験は
肺をsingle cellにした後、
CD45の抗体でリンパ球を染色し、
上皮細胞だけNegative sortするというでしょうか？

そのとうりです。single cellにしたあと、CD45、CD31をdepletionして、上皮細胞だけ、negative sortするということです。
buffer作らなかったのは手抜きでした。EDTAいれないといけないと思いつつ大丈夫かなとさぼってしまいました。

＞AutoMACSを使っているのならプログラムはなんでしょうか？
　貧乏でAutoではありません。

NegativeならDep05がお勧めです。
　カラムは検討してみます。

本当に助言ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.1092-7 - 2008/05/08 (木) 22:45:11 - amits
＞polyclonalのほうがいいのでしょうか？

なんでバッファー作らないんですか？

なんでWashしないんですか？

(無題) 削除/引用
No.1092-6 - 2008/05/08 (木) 20:13:43 - りょう
buffer組成。wash。
手抜きすぎでしょう。

抗体とビーズの組み合わせは？ 削除/引用
No.1092-5 - 2008/05/08 (木) 20:10:24 - ema
抗体とビーズの組み合わせは？
私はCD45の方が欲しくてやったのですが
CD45ダイレクトビーズでやったときに特に分かれない気はしませんでしたが。その他の組み合わせはCD45-FITC Or PEに対してFITC,PEビーズでもNegativeに少々残ったことはありますが、あまり、、、。
除去でなら２回かけるというのもあります。
ただ、種対応mouse,rabbit-IgGのビーズのときはCD45ではないですが組み合わせがうまくないのか、とれにくいことはありました。
AutoMACSを使っているのならプログラムはなんでしょうか？
Positiveをきれいにとるなら私はPosceld2が
NegativeならDep05がお勧めです。

ありがちですが、ビーズの染色はなるたけかいてあるBufferで、4℃染色（冷蔵庫が一番コントロールいいです。氷上ならかいてある時間より長めに）ビーズの洗いは1回でいいからしたほうが。

(無題) 削除/引用
No.1092-4 - 2008/05/07 (水) 17:25:07 - あ
rokumaouさんの実験は
肺をsingle cellにした後、
CD45の抗体でリンパ球を染色し、
上皮細胞だけNegative sortするというでしょうか？

これだけの情報ではなんとも答え様がありませんが、
MACSで細胞を分離するときには、
せめてBSAかFCSを加えないと、分離が良くないと思います。
あと、接着細胞の分離をしようとしているのなら、
EDTAは入れておいた方がいいとおもいます。

(無題) 削除/引用
No.1092-3 - 2008/05/07 (水) 15:06:56 - rokumaou
MACS前のフローサイトメーターで明らかにCD45陽性細胞はいました。ところが、MACS後にも細胞のポピュレーションは変わっていませんでした。
となると抗体はworkしているということになるのでしょうか？
あと、ずるして、ビーズは洗わずにやってしまいました。

分離前の確認は？ 削除/引用
No.1092-2 - 2008/05/07 (水) 15:01:46 - あ
MACSで分離する前に、その抗体で染まる細胞はいましたか？

MACS 磁気細胞分離法について 削除/引用
No.1092-1 - 2008/05/07 (水) 14:42:43 - rokumaou
MACSがうまくいかなくて困っています。
マウスの肺胞上皮をisolationしようとしています。proteaseで肺を溶かし、CD45陽性の細胞を分離しようとしたのですが、あまり（というかほとんど）、分離されていません。
使用した抗体はe-bioscienceのmonoclonal抗体です。
考えられる点として、抗体の濃度（論文には1.5ug/million cellとの高濃度と書いてあるのですが、あまりにも濃いので、添付文章どうり（0.5ug/cell)にやりました。
もう一点ですが、MACSでソートするときにbufferをPBSでやってしまいました（説明書には、labeling buffer PBS with 2mM EDTA、BSA freeと書いてありますが気にせず、PBSでやりました）

印象として、抗体が機能していないと考えています。濃度のせいなのか、抗体が悪い？polyclonalのほうがいいのでしょうか？
全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を