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(無題) 削除/引用 No.1088-9 - 2008/05/07 (水) 11:22:14 - おお >[Re:8] 名無しさんは書きました : > おおさん、お返事ありがとうございます。 > > > いいと思います。もし、希釈系列をを作って、どの辺でシグナルが弱くなっていくかというふうにすると、わかり易いかもしれません。 > 今度は、希釈系列でやってみようと思います。 > 1、5μg/laneで、1次1:1000、2000、2次1:2000、5000、10000くらいで。 あ、私が言いたかったのはサンプルの希釈系列です、、、でも最終的にいい条件が見つかればそれでもいいですが、、、 > > > たしか、Kにライゲーションされたユビキチンがあったと思いますが、 Kにライゲーションされたユビキチン ->Kにライゲーションされたユビキチンに対する抗体 訂正いたします。

(無題) 削除/引用 No.1088-8 - 2008/05/06 (火) 19:06:49 - 名無し おおさん、お返事ありがとうございます。 > いいと思います。もし、希釈系列をを作って、どの辺でシグナルが弱くなっていくかというふうにすると、わかり易いかもしれません。 今度は、希釈系列でやってみようと思います。 1、5μg/laneで、1次1:1000、2000、2次1:2000、5000、10000くらいで。 > たしか、Kにライゲーションされたユビキチンがあったと思いますが、それを使ってELISAとかすると定量的でわかり易いのではないでしょうか(私はその抗体の使い勝手やELISAのアプリケーションについては分からないので、系の樹立という所から始めないと行けないかもしれませんが、、、)。 ELISAはやったことが無いので・・・。最悪、必要にかられたらするかもしれません。 > あと、無作為にユビキチンかしたタンパクがたまるというのは、ウエスタンでシグナルが上がっているだけでは言えないのではと思いますが、、、(他にサポートするデーターなどがあるならいいでしょうけど)。ランダムにタンパクを数個選んでIPするのもいいかと思えますが、、、 うーん、、、プロテアソームの活性を見る前にウエスタンの方が慣れてるから先にみておこうと思ったのですが・・・。 そして、他のpaperは見事にLaneいっぱい黒くなっているので、できればランダムに選ばず全lysateでもう少し頑張ってみます。 いろいろご指導ありがとうございました。 とりあえず上記を試してみることにいたします！

(無題) 削除/引用 No.1088-6 - 2008/05/06 (火) 15:15:01 - おお >（前述の量はすでに自分では結構減らしたつもりなのですが。1μg/Laneとか >でもいいのでしょうか？） >ご教授よろしくお願いいたします。 いいと思います。もし、希釈系列をを作って、どの辺でシグナルが弱くなっていくかというふうにすると、わかり易いかもしれません。あとは、抗体の量もへらして、そのコンビネーションでいい条件を見るけられるといいかと思います。 たしか、Kにライゲーションされたユビキチンがあったと思いますが、それを使ってELISAとかすると定量的でわかり易いのではないでしょうか(私はその抗体の使い勝手やELISAのアプリケーションについては分からないので、系の樹立という所から始めないと行けないかもしれませんが、、、)。 あと、無作為にユビキチンかしたタンパクがたまるというのは、ウエスタンでシグナルが上がっているだけでは言えないのではと思いますが、、、(他にサポートするデーターなどがあるならいいでしょうけど)。ランダムにタンパクを数個選んでIPするのもいいかと思えますが、、、

名前について 削除/引用 No.1088-5 - 2008/05/06 (火) 14:48:15 - 名無し ところで、今過去トピを見ていると名無しさんと いう方がすでにいらっしゃるのですね。（しかもたくさんの質問に 答えてらっしゃる。） 私は、しがない学生ですので、次トピを立ち上げる時からは 別名に致します。 すいません、名無しさん。

(無題) 削除/引用 No.1088-4 - 2008/05/06 (火) 14:43:38 - 名無し うーんさん、おおさん、早急なお返事ありがとうございました。 > MGかまさなくてもanti-Ubでblotすると相当出ます。 そうなんですか・・・。 実は、MG132はポジコン用Laneとしていれておりまして、 ある薬剤がproteasome inhibitorとしての機能があるというのを証明 しようとしております。 既に、他の細胞（Hela、だったかな？）ではそれが証明されておりまして、 その時の図が、コントロールはLaneが真っ白で薬剤群は真っ黒だったので、 コントロールはなにも出ないと思い込んでいました。（すばらしくコントラストのついた図でした。） paperにはIPを行ったなどの旨は無かったのですが・・・ > えっと、ライセートをそのままウエスタンすると、インヒビターなしでも、レーン全体にスメアーな感じで(低分子領域はシグナルが弱かったと記憶してますが、、)検出されます。 そのとおりで、低分子領域以外がスメアーに染まっています。 再度質問なのですが、 こういった系の場合、目的のタンパクが非特異的になってしまうのですが、 この場合はIP（やったことが無くよくわかりません。）を行うよりは 量を減らすなど調節していった方がいいのでしょうか。 （前述の量はすでに自分では結構減らしたつもりなのですが。1μg/Laneとか でもいいのでしょうか？） ご教授よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1088-3 - 2008/05/06 (火) 14:26:32 - おお えっと、ライセートをそのままウエスタンすると、インヒビターなしでも、レーン全体にスメアーな感じで(低分子領域はシグナルが弱かったと記憶してますが、、)検出されます。特定のたんぱく質を見たい場合はIPをかますのが、一般的です。 インヒビターを加えて、ライセイトのウエスタンでどこまでさが見られるかは、なんともいえませんが、全体に黒くなってしまうじてんで、フィルム上ではほとんど検出の上限で差が出ないと思いますので、もしやるとしたならアプライする量を1/10ぐらいまで落としてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1088-2 - 2008/05/06 (火) 14:20:33 - うーん >>そんなにユビキチン化されたタンパクが定常状態であるのでしょうか？ あります。 MGかまさなくてもanti-Ubでblotすると相当出ます。 なので、なにか目的のタンパクをIPで落として来て、MGの評価をされるのがいいと思いますが。 あるいは蛋白量を下げたり、exposeの時間をさげればDMSO群との差は見えてくるかもしれませんが。 僕の経験上の話ですが 。

proteasome inhibitorについて　ウェスタン検出 削除/引用 No.1088-1 - 2008/05/06 (火) 13:58:21 - 名無し 現在、プロテアソーム系の実験を行っております。 proteasome inhibitor（MG132とか）の薬剤を添加して、westernで 非特異的タンパクがubiquitinationされているmultibandの検出を 行おうとしております。 同じサンプルからp53やcaspase3、actinバンドは問題なく検出されているので、 サンプルには問題ない？と考えているのですが、 コントロール群（DMSO付加のみ）、薬剤添加群（MG132なら20μM8時間） でも同様にバンドが出てしまいます。（Laneが一様に真っ黒に。） なぜコンロトール群も黒くなるのかが全くわかりません。 そんなにユビキチン化されたタンパクが定常状態であるのでしょうか？ サンプルは10-20μG/Laneで、ブロッキングは５％スキムミルク１ｈ １次抗体1:2000（モノクロ） ２次抗体1:5000　各々1時間、その後ECLで検出しております。 お忙しいとは思われますが、どなたかご教授お願いします。

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