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(無題) 削除/引用 No.1078-9 - 2008/05/13 (火) 03:22:36 - カナマイシン >L様 有用な情報をありがとうございました。 やはり、市販品より少し劣るかな、といった感じなのでしょうかね。 あまり期待しすぎずに dam-/dcm- でも作ってみようかな、と思います。

(無題) 削除/引用 No.1078-8 - 2008/05/09 (金) 12:51:21 - L 最近は遺伝子から離れておりまして、エレポ用のコンピを作っていないのですが、 遺伝子の仕事をしているメンバーに聞くと、 「DH5aにpGEM-5zfで10^8から10^9」 とのことでした。 ロット間のバラつきは、主に製作者のウデで変わることですが、あまりないと聞きます。 氷上で操作すれば、まず問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1078-7 - 2008/05/09 (金) 09:58:25 - カナマイシン レスポンスいただきありがとうございます。遅くなり申し訳ありません。 エレポ用コンピがこんなに簡単なものだとは思ってませんでした。 「新鮮なグリセロールストック」とほぼ言い換えられてしまう品なんですね〜。 普段はケミカルでやってますが、古い機械があるのでやってみようかな。 ちなみにL様、自作時の効率はどんなものでしょうか？ 企業がうたっているような高い効率は出るのでしょうか？ また、ロット間の安定感はどうでしょうか？ ロット間でばらつくような複雑な作業もない気がしますが… う〜んと様、ご意見ありがとうございます。 dam-/dcm- でやるのはわけがありまして、 そこで作ったプラスミドライブラリを他の細菌に導入するのですが、 制限修飾系の関係でdam-/dcm-でないと入らないのです。 遠回りでも安定感があるのは、 PCR →ライゲーションしてdam+/dcm+株に導入 →十分数のコロニーから（液培せず）直接プラスミドプレップ →dam-/dcm-株に導入 →十分数のコロニーから（液培せず）直接プラスミドプレップ なのでしょうが、dam+/dcm+の段階で遺伝子が偏ってしまうのが心配です。 できれば直接dam-/dcm-に入れられればなぁ、と思っております。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1078-6 - 2008/05/08 (木) 10:32:22 - L エレポのコンピ作製は割とラフですね 前日に、LBにストリークした大腸菌を3 ml のLBに植菌して、37℃で振ります。 これとは別に500 mlのLBを滅菌しておいて、37℃にキープして置きます 翌日、3 mlのcultureを全量、500 mlに加えて、吸光度が0.5-1.0になるまで37℃で振ります。 培養が終わったら、菌体を回収して、氷冷した滅菌水で２回、氷冷した10%グリセロールで１回洗って 氷冷した10%グリセロールに懸濁 液体窒素で急速冷凍して、-80℃でkeep 一部は、適当なプラスミドを導入してcfu測定 ポイントはあらゆる操作を低温に保つ、ということでしょうか

(無題) 削除/引用 No.1078-5 - 2008/05/07 (水) 20:08:34 - う〜んと 自分でやってるわけでも、ちゃんと調べたわけではないので、ええ加減な話として。 エレポのコンピ作製はDWで洗うだけでOKみたいなことを聞いた気がします。 ケミカルコンピ作るより簡単で商品価値がないので製品化されてないのでは？ メチラーゼ欠損株でしかライブラリー化できないのでしょうか？ 一般に欠損株はプラスミドが不安定になるので、野生株でスクリーニングして必要があれば欠損株に移すと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.1078-4 - 2008/05/02 (金) 18:28:02 - カナマイシン 早速のご返信ありがとうございます。 >T様 NEBのものは目を通したのですが、やはりユニットは10^6レベルなわけですよね… 普段使ってる dam+/dcm+ のコンピが最低でも 10^8 あると考えると、 その1/100かぁ、と考えると、少し尻込みしてしまいます。 実際は試してみないとわからないですが。 とりあえず試してみようかな。ご意見ありがとうございます。 >KO様 エレクトロなコンピを自作する、ということでしょうか。 私もケミカルよりエレクトロポレーションの方が効率高いとは聞いていまして、 ただ自作した経験のある人が周囲にいないエレクトロコンピを自作するのと、 ケミカルを会社から買うのと、どちらが効率がいいかは微妙だな、なんて 考えてしまっている次第です。 dam-/dcm-のエレクトロポレーション用コンピが売っていれば最高なんですが… フェノクロ・エタ沈をしっかりやる、という意見、参考になります。 普段ケミカルしか使ってないものでして。 ありがとうございました。

理由は知らないのですが、 削除/引用 No.1078-3 - 2008/05/02 (金) 17:49:42 - KO dam-/dcm-の大腸菌は形質転換効率が 悪いと聞いたことがあります。 ケミカルでなく、エレクトロポレーション でやると一般に１−２桁高い効率が得られます。 お試しになってみたらいかがでしょうか。 その際には、ライゲーションしたプラスミドを フェノクロ・エタ沈して奇麗にしたほうが断然良いです。

(無題) 削除/引用 No.1078-2 - 2008/05/02 (金) 15:29:30 - Ｔ 市販のものを買えばいいのでは？ 例えば http://www.neb.com/nebecomm/products/productC2925.asp

dam-/dcm-で形質転換効率の良い大腸菌株 削除/引用 No.1078-1 - 2008/05/02 (金) 14:41:01 - カナマイシン 現在、dam-/dcm-で形質転換効率の良い大腸菌株を探しております。 いま持っているのはJM110の自作ケミカルコンピなのですが、 プラスミドライブラリを作りたい関係で効率のよいものを探しております。 理想としては･･･ ・PCR産物（1 kb）を末端制限酵素処理し ・pBR322 ori のベクター（6 kb, JM110等dam-/dcm-株からプラスミド調製したもの）と ・ライゲーション→トランスフォーメーション で、dam-/dcm- 株由来で10^3から10^4のコロニーを得たい、と思っています （もちろんDNAに関してはしかるべき大容量で切り貼りします）。 上記実験が現実的であるような（曖昧ですが）効率の良いdam-/dcm- 株を ご存じでしたらご教授願います。 あまりに現実的でないようならば戦略を変えようと思っています。 ･･･そもそも「dam-/dcm-」と「高形質転換効率」とは相容れないものなのでしょうか？ それとも企業努力がされてないだけなのでしょうか？

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