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(無題) 削除/引用 No.1064-14 - 2008/05/16 (金) 06:33:00 - ええ （しばらくチェックしていませんでした。すいません。いまさらですが、） 細胞数に関しては、 6センチディッシュにサブコンフルエントで細胞を準備して、 3分割して、そのうちの一つが1IP分に相当するという感じでやっていました。 （抗体によっては、10センチディッシュでやったりもしていました。） （ダイゴさんと同程度だと思います。） 私も、CHIPがうまく行っているかどうかのテクニカルなポジコンとして、 必ず、ヒストン抗体のCHIPを行っていました。 これが走っていないときは、アッセイ自体がうまくいっていないと思ってよいと思います。 そして、アッセイ自体は問題ないのに、C-20抗体でうまく走らないのなら、そのプロモータには、p65の関与がそれほどでもないのかも知れませんね。

(無題) 削除/引用 No.1064-13 - 2008/05/08 (木) 14:26:56 - NN ダイゴさん＞ どうもありがとうございました。とりあえず、抗体を変えてみようかと思っております。勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.1064-12 - 2008/05/08 (木) 13:10:27 - ダイゴ ＞アセチル化ヒストンでは、ネガコンがでてこないサイクル数でバンドをだすことができています。 失礼しました。 ＞ＣＨＩＰでは、目的蛋白（抗体）が変わってしまうとポジコンとして成立しないような気がするのですが、どうでしょうか？ 手技上の問題がなければ、仰る通りです。 マクロファージ系の細胞ならp65は易しい方だと思います。その他の細胞では存じません。

(無題) 削除/引用 No.1064-11 - 2008/05/08 (木) 09:00:30 - NN ダイゴさん＞ ありがとうございます。 アセチル化ヒストンをポジコンにおくという件なのですが、同じ手法をとっても、アセチル化ヒストンでは、ネガコンがでてこないサイクル数でバンドをだすことができています。 なので、手技としてはあまり間違いないのではと思っております。 アセチルヒストンなどは、落ちてきやすく、転写因子は難しいと聞きます。 ＣＨＩＰでは、目的蛋白（抗体）が変わってしまうとポジコンとして成立しないような気がするのですが、どうでしょうか？

ポジコン大事 削除/引用 No.1064-10 - 2008/05/07 (水) 19:09:49 - ダイゴ ええさんじゃなくて、すみませんが。。ネガコンでバンドが出てしまうようでは特異的に落ちてきていませんネ。 私もc-20で上手く行っていました。細胞数は1-2X10^6/IPでした。NNさんの抗体が使えるかどうかは核蛋白を抽出してIP-westernしてみればだいたい分かると思います(westernのときは抗体の種を変えて)。あとChIP自身が上手く行っているというポジコンを置く必要があると思います（例えば、お使いの細胞でアセチル化ヒストン抗体とかを使って。おおさんの回答を少し噛み砕いて一例を挙げるとすると）。

(無題) 削除/引用 No.1064-9 - 2008/05/03 (土) 14:35:45 - NN ええさん＞ ありがとうございます。 ちなみに、１抗体につき、細胞数はどのくらい用いられましたでしょうか？ 最後のPCRでかなりサイクルをあげないとバンドがえられず、細胞数がすくないのが原因かなとおもっております。 しかし、サイクルをあげると、IｇGバンドもでてしまい、困っております あと私は　NFκB p65 (A): sc-109を使っております。 ええさんのほうがいいのかしら・・・

(無題) 削除/引用 No.1064-7 - 2008/05/03 (土) 00:18:59 - ええ 僕個人の経験では、santa cruzの NFκB p65 (C-20): sc-372　はCHIPでワークしました。 p50だと、いくつか試しましたが、 うまくいったりいかなかったりでした。 （どちらかというと、安定していない印象でした。） ポリクロの抗体だと、ロットが変わると、 ワークしなくなったりするので、 そういう意味では、結構厄介かも知れません。 うまくいったら、同じロットで、 買いだめしといた方がいいかもしれません。 CHIPの論文は、僕自身で試した中では、 再現性が取れないのも少なくなかったです。 抗体のロット、テクニカルな理由、その他…、 というところでしょうか。 たしかに、簡単ではないですね。

(無題) 削除/引用 No.1064-6 - 2008/05/02 (金) 13:11:45 - NN 分かりました！ 勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1064-5 - 2008/05/02 (金) 03:12:16 - おお 究極的には、既に発表されている実験系を再現してみることです。そのことによって実際の実験で何が重要であるとか色んなことが分かってくると思います。うまく行く実験系か分からないでやる実験は、何の結論も生まない可能性があるので、それが重要な実験であれば、実験系が働いているかなるべくはっきりさせる必要性があると思いませんか? ですから、違う細胞でもなんでも良いですから系がうまく行くという確信をもつ事がまず大事で、それで貴方の本来の実験でうまく行くか実験するべきです。そうすると、うまく行かない時の考察がしやすいと思いませんか?

(無題) 削除/引用 No.1064-4 - 2008/05/01 (木) 16:38:31 - NN ポジコンなのですが、私が使用している細胞で、同様な刺激を加えることでNFｋBがrecruitされることが分かっている部位をPCRするということですよね？ それが今のところ、ないのが現状です。他の細胞ではあるのですが

(無題) 削除/引用 No.1064-3 - 2008/05/01 (木) 15:47:03 - おお あとポジコンとか同時にやっているでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1064-2 - 2008/05/01 (木) 15:44:57 - おお 直接的なアドバイスは出来ませんが、IPはポリクロで特に抗原として、比較的長い領域(ペプチドでなくリコンビナントとか)を使ったものの方が回収効率がいい場合が多いです。 理由は説明しなくても大丈夫だと思いますが、、、 ですから、抗体のを作った時の抗原についてもチェックして見てはどうでしょうか。あと文献などの調査もされてみてはどうですか?

NFκB抗体 削除/引用 No.1064-1 - 2008/04/30 (水) 00:35:02 - KK CHIP assayでNFｋBの免疫沈降を行っています。 抗体についてなのですが、現在SantaCruz社のpolyclonal抗体を用いていますが、なかなかうまくいきません。 他社でここのNFｋB抗体がおすすめというのがありましたら教えてください！！ あと、Chip assayでもちいるのは、monoclonal抗体よりpolyclonal抗体の方がよいのでしょうか？

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