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(無題) 削除/引用 No.1054-8 - 2008/05/01 (木) 14:51:33 - AP AP-NBT/BCIPでうまくいったときも、PO-TSA-Cy3でスカだったときもプロープやハイブリの系は一緒なわけですよね。 AP-NBT/BCIPで成功したのだから、ハイブリまではうまくいっているはずでしょう。デキストランはハイブリを促進するために入れるものですし、その他のハイブリ条件も、PO-TSA-Cy3でうまくいかなかった主因とは考えにくいです。 APとPOでは、APの方が寿命が長く総ターンオーバーも高い（確かPOより一桁くらい）ので酵素反応による増幅という意味ではPOの方が劣る面はあります。 しかし、TSAはPOの検出力を効率よく利用しているシステムで（と思っていますが）、しかも一般に色素検出より蛍光検出の方が最低一桁は感度がいいことになっているはずなので、感度的にAP-NBT/BCIPより非常に劣る（しかもバックグラウンドすら全く見えなくなる）とは思えないのですが。 ということで私が疑いを抱いたのは、anti-DIG-POの品質なのですが、 POはAPよりはるかに失活しやすいですから、もし開封、再溶解してから時間がたったものでしたら、酵素活性をチェックするとか、新品に変えるとかしたほうがいいのではないでしょうか。開封間もないものでも、念のためチェックしてみては。

(無題) 削除/引用 No.1054-7 - 2008/05/01 (木) 12:58:58 - in situ >しつもんさん >>1.私はRocheのAnti-DIG-POD抗体とPerkin Elmer社のTSA-蛍光チラミドシステムを使いましたが、そちらは試されたことありますか？ 自分はRNAの細胞内局在を詳細に観察することが目的なので、そのシステムは使ったことがありません。 ただ、hybridizeまでの過程は基本的に同じはずなので、まずは低温・低塩濃度で長時間hybridizeを試されることをお勧めします。 >>2.私のprotocolでは、抗体希釈液に0.05%Tween20が含まれていますが、それは問題ないでしょうか？ 非特異結合を減らすために入れているのだと思いますが、一回除いてやってみてシグナルの増強が見られればのぞいてみるのも良いと思います。 ただ、アジド（NaN3）がPODを失活させるという話を聞いたことがあるので、アジド入りのスキムミルクとかで抗体希釈するのはまずいです。 >>3.anti-DIG sheepポリクロのメーカーと希釈倍率は教えていただけませんか？ Rocheのもので1/1000で使っています。 組織さんが挙げておられるRocheのHNPP/FastRed TR検出キットですが、自分は細胞内局在を詳細に観察したかったので使いませんでしたが、組織レベルでどの細胞が標的RNAを発現しているのかを見たいだけなら使ってみる価値はあると思います。 ただ、TSAも原理としては同じで、どちらが感度が良いのかはわかりませんが…

(無題) 削除/引用 No.1054-6 - 2008/05/01 (木) 10:51:03 - 組織 横から割り込んで申し訳ないですが、RocheのHNPP/FastRed TR検出キットはいかがでしょうか？ AP酵素を利用した蛍光発色で検出するため、検出以外の操作はAP-BCIP/NBT系とほぼ同じです。 結構このキットを使ってますが、今のところBCIP/NBT系と同じ結果が得られています。微調整として、プローブをやや希釈（BCIP/NBT使用時の2-10倍希釈）するくらいです。 ISHと免疫染色の二重染色もうまく染まっています。

(無題) 削除/引用 No.1054-5 - 2008/05/01 (木) 03:23:34 - しつもん >in+situさん 詳細なアドバイスありがとうございます。もう少しだけ質問させて下さい。 1.私はRocheのAnti-DIG-POD抗体とPerkin Elmer社のTSA-蛍光チラミドシステムを使いましたが、そちらは試されたことありますか？ 2.私のprotocolでは、抗体希釈液に0.05%Tween20が含まれていますが、それは問題ないでしょうか？ 3.anti-DIG sheepポリクロのメーカーと希釈倍率は教えていただけませんか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1054-4 - 2008/04/30 (水) 12:07:08 - in+situ embryoではなく、培養細胞でしかやったことはありませんが、自分が経験した状況と多少似ているのでコメントさせていただきます。 自分の時も DIG標識RNAプローブ＋AP標識anti-DIG＋NBT/BCIP 検出のときはばっちり検出できていたのに、蛍光検出にしたとたんに全くシグナルが出なくなりました。 AP検出は酵素で数千倍に増幅をかませていますので、このような状況は結構あるんじゃないかと思われます。 解決法として ・permializeのときのTritonX-100の濃度を0.5%と濃くする ・ハイブリ時の塩濃度を下げ、温度を42℃と低くして二日間 ・DIG標識RNAプローブ＋anti-DIG sheepポリクロ＋Alexa標識anti-sheep を試した結果、大変良いS/N比が得られました。 現在は、ほぼ同様のプロトコルで ビオチン標識RNAプローブ＋Alexa標識streptavidin という検出系も成功しています。

(無題) 削除/引用 No.1054-3 - 2008/04/29 (火) 23:47:01 - しつもん コメントありがとうございます。そういう意味だったのですね。ただ、私の場合は、一度だけしか試してないのですが、AP発色で強いシグナルが出たものと同じprobeにもかかわらず、蛍光ではシグナルがゼロで、バックも含めて全体的に色が弱かったです。ProteinaseK処理をskipしたのが、大きな原因かと思ってますが、蛍光用のprotocolに厳密に従わずに、AP発色で使ったものと同じdextran sulfate入りhybridization bufferを使ったのも気になっています。あとは、蛍光の場合でもプレハイブリの処理はAP発色のprotocolと同じでもいいのか、経験者がいたら教えて欲しいです。

(無題) 削除/引用 No.1054-2 - 2008/04/29 (火) 12:43:22 - at3 dextran sulfateの有無は、hybridizationの効率に影響します。（Rocheのin situ マニュアル3rd p35参照） TSAを使っている系では、dextran有だと感度が高すぎるので、抜いているのではないでしょうか？ TSAの系では、抗体=酵素の量が多すぎてもいけないので、probeの感度を多少落としているのだと思います。 また、Hybri bufferの組成は人それぞれなので、たまたまなのかもしれませんけど。蛍光だから、dextranを使えないというわけではないと思います。 シグナルがないのか、ハイバックなのか具体的に状況を書かれたほうがよいかもしれません。また、必ずしもTSAでの増感が必要なのでしょうか？

蛍光ISH法 削除/引用 No.1054-1 - 2008/04/29 (火) 07:41:41 - しつもん マウスのembryoでDIG標識(AP発色)によるin situ hybridizationできれいなシグナルを確認できました。将来的に、免疫染色とのdouble stainingをしたいので、ボスから蛍光を試すように指示されたのですが、うまくシグナルが検出できませんでした。普通のAP発色では、hybridization bufferにdextran sulfateを含めているのですが、蛍光のprotocolにはdextran sulfateが入っていませんが、どうしてでしょうか？signalに影響を与えることがあるのでしょうか？Perkin ElmerのTSA Cyanine3 systemというのを使っています。蛍光でうまくsignalを検出できた方がいたらアドバイスお願いします。

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