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genomic DNA　の回収 トピック削除
No.1043-TOPIC - 2008/04/27 (日) 03:55:40 - DNA
現在、genomicDNAに関しての実験を始めようとしていますが、最初の段階で躓いています。
genimic DNA回収用の試薬（DNAzolなど）を用いて細胞からgenomicDNAを回収する際に、EtOHを加えた後に沈殿物というか「モヤモヤしたもの」をDNAとして回収するプロトコールになっていますが、皆様はどのようにこれを回収していますでしょうか？
量が少なかったせいもありますが、回収し、wash後に確認したところ、上手に取れずに完全にロスしてしまいました。
ちなみに、回収はピペットチップの先を用いて、巻き取るように回収し、それをwash用の75%EtOH中にて落とし、washを行なっています。
ひょっとしたら、そこに落ちていなかったのかもしれませんし、チップの先に入り込んだのかもしれませんが、確認は出来ませんでした。
皆様の経験や方法を教えてもらえたら助かります。
　
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No.1043-6 - 2008/04/29 (火) 22:38:42 - rik
私は10mM Tris/HCl(pH8), 1mM EDTAに溶解しています。エタ沈したゲノムを溶解すると透明になって一見溶けたように見えますが均一にはなっていませんので50℃の温浴槽で一晩インキュベートしています。用途によっては凍結保存しても良いと思いますが、私はなるべく剪断させたくないので４℃保存です。NaOHは使用した経験がありません（というか知りませんでした）。

もう一つの質問 削除/引用
No.1043-5 - 2008/04/29 (火) 21:24:33 - DNA
皆さんありがとうございます。
当たり前のことですが、やはり各ステップ毎での確認しながら進めていくようにします。
ところで、もうひとつ疑問があるのですが、
プロトコールには最終的なgenomic DNAの溶解を「8mM NaOH」で行なうように記載されていますが、RNAなどと同様にDEPC waterもしくはRNase/DNase free waterでの溶解ではダメなのでしょうか？
もしよろしければ教えてください。

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No.1043-4 - 2008/04/27 (日) 18:54:30 - rik
ゲノム釣りの最大の特徴はターゲットが目視できることですので、ゲノ子さんのおっしゃるとおり目で確認しながら操作すれば絶対に失う事はありません。
モヤモヤした状態のゲノムは粘性が高いので、釣り上げに使うチップの先端のカット面（よく見ると粗造になっていますよね）にくっついて離れにくくなる事がしばしば起こりませんか。私は、浮遊している状態のモヤモヤゲノムをチップの腹の部分（ここは表面がつるつるしてくっつきにくい）でチューブの壁に押しあてて潰します。水分を絞り出すような感覚です。するとゲノムは次第に透明感が無くなって粘着性も低下します。そうしたらチップの先端で引っ掛けて洗浄用の70％エタノールに移します。こうすれば失う事はないですよ。ゲノム量が充分あるならAPさんのようにキャピラリーグラスを熱加工してフックを作るとよいと思います。ゲノム釣りはビジュアル的にも楽しいし、学生実習にもってこいですよね。

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No.1043-3 - 2008/04/27 (日) 18:21:42 - ゲノ子
「モヤモヤしたもの」が一度は見えたなら、チップでの回収、別チューブのEtOHへの落とし込み、washの全てのステップにおいて、その沈殿を目視で確認しながら行うべきです。落ちていなかったとか、チップの先に入り込んだとか、そんなことが起こり得るような操作をすべきではありません。

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No.1043-2 - 2008/04/27 (日) 08:44:01 - AP
ゲノムDNAでも量が少なかったり、操作による剪断よって、巻き取りやつり上げが困難になることはあります。
そういうときは、ふつうのEtOH沈殿と同じように遠心して回収すればよいです。
というか、つり上げて回収するのはゲノムライブラリーを作るなどの目的で、大量のゲノムDNA（数 ug以上）を剪断力がかからないように特に慎重に精製したときくらいしかやらないです。SouthernやPCRに使うならその必要はないです。遠心だとRNAなど不純物も沈殿しますが、それが問題になることもないでしょう。

ゲノムDNAをつり上げて回収するのに、私はガラスキャピラリーの先端をバーナーで焼きつぶしたり、フックにしたものを使います。

genomic DNA　の回収 削除/引用
No.1043-1 - 2008/04/27 (日) 03:55:40 - DNA
現在、genomicDNAに関しての実験を始めようとしていますが、最初の段階で躓いています。
genimic DNA回収用の試薬（DNAzolなど）を用いて細胞からgenomicDNAを回収する際に、EtOHを加えた後に沈殿物というか「モヤモヤしたもの」をDNAとして回収するプロトコールになっていますが、皆様はどのようにこれを回収していますでしょうか？
量が少なかったせいもありますが、回収し、wash後に確認したところ、上手に取れずに完全にロスしてしまいました。
ちなみに、回収はピペットチップの先を用いて、巻き取るように回収し、それをwash用の75%EtOH中にて落とし、washを行なっています。
ひょっとしたら、そこに落ちていなかったのかもしれませんし、チップの先に入り込んだのかもしれませんが、確認は出来ませんでした。
皆様の経験や方法を教えてもらえたら助かります。
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