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ありがとうございます！！ 削除/引用 No.1024-6 - 2008/04/28 (月) 13:47:13 - ひまわり 返信遅れてしまいすみません！！ そしてコメントありがとうございますn(_^_)n SNOさん はい、Upstateなどで購入を予定しています。 また分からない事が出て来た時には教えて下さいn(__)n よっしーさん 種によっても活性異なるんですね、初めて知りました。 今使用しているLPSはシグマの0111株から得られたものでよく用いられていたので購入しました。 古いとミセルを作り活性が落ちると聞いた事があります。 また宜しくお願い致しますn(_^_)n

(無題) 削除/引用 No.1024-5 - 2008/04/25 (金) 09:51:58 - よっしー 本題とは離れていますかもしれませんが， LPSは由来の菌によって反応性は様々です． また，古いLPSは活性が非常に弱くなっている可能性があります． (以前それで失敗しました) 一般的に大腸菌よりもサルモネラ由来のLPSの方が反応性が高いと思います． (大腸菌でも株によって反応性は違います) 参考までに・・・．

マウスのIFN 削除/引用 No.1024-4 - 2008/04/25 (金) 00:37:08 - SNO RAWにはマウスのIFN-gを使うとよいでしょう。 LPSも製品によって効果に違いが出ますね。 グリース法は細胞から放出されたNOの酸化物であるNO2を測定するものですから、detergentは使わない方がよいでしょう。TritonX-100は、WBのためのタンパク質を抽出することに対するコメントのつもりでした。 LPSとIFN-gをRAW細胞にかけて刺激して、メディムが黄色く変色するくらいになっているのに、グリース法やWBで反応が見られないとしたら、別の理由を検討した方がよいでしょうね。

コメントありがとうございます。 削除/引用 No.1024-3 - 2008/04/24 (木) 12:22:57 - ひまわり おはようございます。 SNOさん、アドバイスありがとうございます。 IFN-gammaとの組み合わせで試すべきなのですね、RAW264.7でもLPS単独で刺激したのですが、 タンパクでは検出できませんでした。 次回、IFN-gammaとやってみます。ありがとうございます。 もうひとつ教えて頂いてもいいでしょうか？ グリース試薬を用いたんですが、予想通りLPS単独では6, 12, 24時間の培養上清でも検出できませんでした。SNOさんがおっしゃられたTrytonX100で壊すと多少は改善されるのでしょうか？ 素人的な事を聞いてしまいすみません。 実は、R&DシステムのIFN-gamma測定kit(消費期限2003年)に付属して付いてきたrecombinantで凍結乾燥品のIFN-gammaを使ってやってはいたんですが、LPSによるiNOSのmessage誘導に相乗効果はみられませんでした。かなり古かったのですが、凍結乾燥してあったので試してみただけなんですが。。そもそもそのrecombinantが活性があるかどうかは分かりません。 SNOさんがおっしゃるようにちゃんと活性のあるIFN-gammaを手に入れて試してみます。 ありがとうございます。n(_^_)n

Positive control 削除/引用 No.1024-2 - 2008/04/23 (水) 23:11:06 - SNO なかなか苦労されているようですね。 近くで誰かRAW細胞を持っている方はいませんか？ RAW264.7細胞はiNOSの誘導がかけやすいので、positive controlに使われることをおすすめします。 IFN-g（マウスの)とLPSを両方かけるとまず間違いなく誘導されます。iNOSタンパク質も誘導開始後、２４時間で見れば大丈夫でしょう。 IFN-g:100 U/ml, LPS: 100 ng/mlあたりで十分でしょう。 グリース法でメディウム中のNO2を測定してみるのも、別法として試されてもよいかもしれませんね。 細胞膜さえ破壊できれば、TritonX-100はなくても大丈夫でしょう。

iNOSの検出方法 削除/引用 No.1024-1 - 2008/04/23 (水) 17:41:59 - ひまわり はじめまして、初めて書き込みいたします。 ご相談したいことがありまして、ここで質問させてくださいn(_^_)n 今、血管内皮細胞にLPSで刺激をして、iNOSをimmunoblotで検出しようと思っています。 しかし、mRNAレベルではしっかり上がっているのに、タンパクが全然検出させずここ数ヶ月前進なしでいます。1 % Tryton-100で可溶化して、タンパクを20 ugほどを流しているのですが、全然だめです。 抗体はBD transductionのanti-mouse iNOS mAbを買いました。 とてもよく論文で使われていたので買って頂きました。 モノクロなので、lotごとで活性にそこまで違いないはずだとは思いますが、、 http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/tl/live/web_enabled/N39120_610431.pdf ネズミの個体にLPSを打ち込んで肝臓などでもiNOSのmessageは上がっているのですが、タンパクではどうしても検出出来ません。 IFN-gammaとcombinationでLPSをうたないとiNOSは検出できないのかもしれません。 種はマウスです。それかinducibleなものなので、すぐに分解されちゃうのかなあとも思います。 もしこのトピックを見られた方、ご存知でしたらどうか教えて頂けないでしょうか、宜しくお願い致します。 論文だと普通にiNOS検出できてるので、何かがおかしいのだとは思うのですが、 それかmessageとしてみていたものがiNOSではないのか…

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