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外来遺伝子のオルタナティブスプライシング トピック削除
No.1017-TOPIC - 2008/04/22 (火) 19:33:59 - 初心者
真核生物のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRである遺伝子を増幅したらそれは産物はイントロンとエキソンを含んでいると思うのですが、これを適当なベクターに入れて動物細胞で発現させてもちゃんとスプライシングされて蛋白質は出来るのですか。またオルタナティブスプライシングとかも内在性のその遺伝子が受けるのと同じように起こるものなのですか。専門がこういう領域でないのと、周りの人は原核生物を材料としている方がほとんどなので、ここで教えてもらいたいとおもい、質問します。
　
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No.1017-7 - 2008/04/23 (水) 09:45:14 - おお
>[Re:6] 初心者さんは書きました :
> いったんhnRNAになったら内在性のそれと基本的には同じものと思うので、おなじようにスプライシングされてmRNAになるのかなあ？そのときタグのところは問題ないかなあ、などとも思いました。もう少し勉強してみます。


alternative splicingも気にされているようなので少しコメントを追加します。スプライシングはプロモーターディペンデントの場合があります。この場合は外来のプロモーターを入れるとその制御を失う可能性があります。タグやプロモーターに関してはやってみないと分からないところがありますので、何種類かデザインを変えて作ってみるのがいいと思います。もしプロモーターがきになるなら内在せいの者を使うてもあるかと思います。
タグに関しての心配は、タグ自体がスプライシングに関して何らかの意味を持っている配列でそれが働いてしまうため全体のスプライシングがおかしくなる場合と、タグを入れたところがたまたま、スプライシングに関して意味のあるところで、その機能がおかしくなってしまう場合です。でも、結構スプライシングを研究している人は大胆にタグをいろんなところに入れたりしています。もちろん入れたあと正常に働くか検証をして事がほとんどだと思います。

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No.1017-6 - 2008/04/23 (水) 09:04:23 - 初心者
みなさんいろいろ教えていただきありがとうございました。分かりました。今考えているのは、人のあるゲノム遺伝子をPCRで増幅してアフィニティータグが付けられるような適切な発現ベクターに入れてヒトの培養細胞へ、という実験です。そういうやり方を見ないので、こういうやり方するとなんか問題が起こるのかなあと思ってました。いったんhnRNAになったら内在性のそれと基本的には同じものと思うので、おなじようにスプライシングされてmRNAになるのかなあ？そのときタグのところは問題ないかなあ、などとも思いました。もう少し勉強してみます。

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No.1017-5 - 2008/04/23 (水) 08:47:16 - おお
追加しますと
マウスーヒト間(哺乳類同士)であればかなりコンバティブルだとは思えます。

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No.1017-4 - 2008/04/23 (水) 08:45:22 - おお
>これを適当なベクターに入れて動物細胞で発現させてもちゃんとスプライシングされて蛋白質は出来るのですか。

できる可能性はありますが、保障はありません。たとえば人のゲノムをSaccharomyces cerevisiaeにほりこんでもほとんど正常にスプライシングしないと思います。人のエクソンーイントロンのジャンクションは可也バリエーションがあり、対応し切れないだろうと考えられるからです。
ハエの遺伝子(ゲノム)の一部を切出し、HeLaの核抽出液でスプライシングを起こすことができたりしますが、かといってはえのげのむすべてOKとはかぎりません。

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No.1017-3 - 2008/04/22 (火) 23:34:09 - PAC
以前、あるヒトの遺伝子が入ったPAC cloneを使ってtransgenic mouseを作りました。マウス内でもヒトと同様のスプライシングパターンを示しました。
A様同様、必ず起こると保証できませんが、可能性はあると思います。

以上参考までに、

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No.1017-2 - 2008/04/22 (火) 20:48:33 - A
以前バキュロウイルス発現系のマニュアルを読んだ際に
長所として「ウイルスに外来性のゲノム遺伝子を導入すると
スプライシングが正しく行われる」と書いてあるのを読んだ
ことがありますから必ず起こるとは思いませんが本来の
スプライシングがある程度行われるのだろうと思います。
オルタナティブスプライシングについてはそれがどうして
起こるのか少なくとも私は知りませんからなんともいえません。
その辺りは種固有の機構かもしれませんし。

外来遺伝子のオルタナティブスプライシング 削除/引用
No.1017-1 - 2008/04/22 (火) 19:33:59 - 初心者
真核生物のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRである遺伝子を増幅したらそれは産物はイントロンとエキソンを含んでいると思うのですが、これを適当なベクターに入れて動物細胞で発現させてもちゃんとスプライシングされて蛋白質は出来るのですか。またオルタナティブスプライシングとかも内在性のその遺伝子が受けるのと同じように起こるものなのですか。専門がこういう領域でないのと、周りの人は原核生物を材料としている方がほとんどなので、ここで教えてもらいたいとおもい、質問します。
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