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(無題) 削除/引用 No.1004-6 - 2008/04/21 (月) 15:58:18 - まろん コンピテントセルの細胞数が多いのでプレートはまだらになりますから、shoshoさんのまき方が原因ではないと思います。X33株はGS115株に比べて形質転換率が低いようです。また、理由はわかりませんがPmeI よりSacIの方が形質転換効率は高いです。まずは、コンピテントセルの作成方法やエレクトロポレーションの条件など適切かどうか確認してください。問題がなければ、用いるプラスミドの量を増やすことと（10-20ug)、YPD培地を添加して１時間さらに培養するとコロニー数が増えますのでまずは試してみてください。それでもだめなら、Wu and Letchworth ( Biotechnique 36, 152-154, 2004)を参考にして、コンピテントセル作製時に10 mMDTT処理、あるいは10mM DTTと 100mM酢酸リチウム処理を行うと飛躍的に形質転換効率は高まります。論文では、DTT処理で形質転換率は２０倍、10mM DTTと100mM酢酸リチウム処理では１５０倍ということです（ただし、pPIC9)。私も試しましたが、効果は抜群です。方法を簡単に申しますと、以下の通りです。コロニーが出るといいですね。 1. 菌体回収後に、0.6Mソルビトールを含む10mM Tris-HCl (pH7.5)に菌体を懸濁する。 2. 1に、10 mMDTTのみ、あるいは10mM DTTと 100mM酢酸リチウムを添加し(最終濃度です）、室温で３０分処理する。 3. 氷令した１Mソルビトール溶液で３、4回洗浄し、１Mソルビトール溶液に懸濁する。

(無題) 削除/引用 No.1004-4 - 2008/04/21 (月) 14:23:31 - 弘法 YPDSプレートというのは聞いたことがないのですが、YPD＋1Mソルビトールのことですか？だとしたら、形質転換体は何で選択していますか？

(無題) 削除/引用 No.1004-3 - 2008/04/21 (月) 12:28:02 - shosho 返事ありがとうございます。今度行ってみます。 親株はx-33を用い、プラスミドは5μgを用いました。制限酵素はPmeとSacの2種類をそれぞれ行いました。 プレートがまだらというか、まいた菌体が多かったのか、なんか汚いんですよね。まき方が悪かったんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1004-2 - 2008/04/21 (月) 12:09:48 - まろん 実験条件を詳しく記載されるとよいアドバイスが受けられると思いますよ。たとえば、使った親株の名前、形質転換に用いたプラスミドの量、プラスミドを切断した制限酵素の名前、エレクトロポレーションの条件等、です。少なくとも、1Msorbitol溶液を添加して１時間静置した後、1mlのYPDを添加して３０℃で震盪培養すると出現するコロニー数は増えます。

酵母へのエレクトロポレーションによる形質転換 削除/引用 No.1004-1 - 2008/04/21 (月) 10:57:07 - shosho 最近エレポをやっているんですが、うまいきません。電流を流したあと、１Mソルビトールに1時間おき、YPDSプレートにまいてます。 1回目：コロニーが生えなかった ２回目：コロニーが一個しか生えなかった 3回目：コロニーが生えなかった 4回目：一昨日行ったところ、プレートがまだら模様になっています。生えなさそう・・・。 なんか原因がありますか？？なんでもいいです。教えてください。

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