Bio Technical フォーラム

  • 書き込みがかなり増えてしまいサーバーの負荷が大きくなったので、新しいBioTechnicalフォーラムに移行してください。
  • 新しいトピックは新フォーラムでのみ立ち上げ可能です。レスは2009年2月15日までつけられますが、その後は、つけられません。

トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム | このフォーラム(readのみ) | ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

膜蛋白の検出 トピック削除
No.1003-TOPIC - 2008/04/21 (月) 10:55:59 - 困った
ASCT2という膜蛋白をWBで検出しようとしています。使うべきLysis Bufferは、RIPA(50mM Tris-HCL, 1%IGEPAL, 150mM NaCl, 1mM EDTA)+PPI(1mM PMSF, 1mMNaF, 1mM activated Na3VO4,protease inhibitor)です。ところが、これに変えてからASCT2どころかβ-actinすら検出できなくなってしまいました。lysis bufferが駄目らしいのはわかりますが、どう改善したらよいかわかりません。
1.RIPAの各溶液は、すべてDDWで溶かして作りました。
2.Tris-HClはTris溶液を作ってからHClを加えながらpHをあわせました。
3.PMSFはisopropanolで溶かしましたが、なかなか溶けにくくすべてを溶か  しきることができません。
4.activated Na3VO4はboilと冷却を2回繰り返しpH10にあわせ、色も黄色から無色透明にしています。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



16件 ( 1 〜 16 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.1003-16 - 2008/04/23 (水) 11:41:19 - おお
>[Re:14] 困ったさんは書きました :
>
> 4.sample bufferにいきなり溶かすというのは、具体的にはどうするんでしょうか。私はラミニ系sample bufferを使っていますができますか。

うまく行くきっかけが見つかったようでよかったですね。ラミニ系sample bufferを使って溶解すればたいていのたんぱく質は溶出されるとおもいますが、今回のばあいは使わない方がいい見たいですね。というのもバッファーの組成を改善してノンスペを減らそうということですから、何もかも溶出してしまいそうなラミニ系sample bufferを使う必要はないと思います。

> 6wellの場合。
> 1.PBSでwash2回。
> 2.lysis buffer100μlでcell scraperを用いながら回収。
> 3.homogenize or pippeting up and down
> 4.microfuge
> 5.回収。
>
> 2、3の時にいつも不安になります。PBSで回収してからlysis bufferを加えるというprotocolもありますよね。その方が、沢山回収できるような気がします。

そんなに問題のあるプロトコールではないと思います。PBSで回収してから、溶解してもいいかもしれませんが、その間非生理的な条件にさらすことになりますので、このプロトコールで出来るならそれでいいかと思います。100ulが確かに少ないので扱いにくいとおもいますが、10cmで1mLぐらいでやることを考えれば妥当な数字です。250ulぐらいまで増やせたら楽になるかなという気がしますが、それは収量や感度などと相談してやっていけばいいかと思います。細胞のポピュレーションが増やせたらボリュームも多めにできますがどうでしょうか。

> 結論として、bufferが問題だったのではなく、蛋白の抽出に問題があったようです。バンドがでていないやつは、bufferの違いによらずsonicationしているものでした。しすぎだったんでしょうか。

ソニケーションについては、たんぱく質の抽出に寄与することが多いのでよく使われますが、同時に一部のたんぱく質のアグリゲーションを促進する事があるようです。そのためソニケーションを避ける人はいます。もう一つは酸化を促進しますので、溶液中の抗酸化作用のある還元剤(DTTや2ーme)を添加することが多いようです。ソニケーションなしのほうがいい様なので今回は使わなくて良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1003-15 - 2008/04/23 (水) 11:09:52 - SDS
人々の一般的な認識としてはSDS-sample buffer=レムリーbufferと一応考えてよいかと思います。要は2~4%程度の高濃度のSDSを含む中性のbufferということで、細胞内のほとんどの蛋白質をほぼ無差別に可溶化することにおいてはlysis bufferの中ではおそらく最強と思います。培養細胞ならばPBSで2回くらい洗ってから少量(10-cm dishでおよそ100%コンフレンシーなら1mlくらいが適量かと思います。量多すぎると蛋白質濃度が薄くなってあとでやりにくいので)のSDS-sample buffer( 2MEとBPBはまだ入れないこと。後でやる蛋白質定量の方法によっては、それを妨害するので。)入れます。ディッシュ全体によく行き渡らせたらライゼートをセルスクレイパーで端っこに集めてピペットで吸って1.5mlか2ml容量のチューブに移します。DNAが出てくるのでかなりドロドロして糸引いていてやり難いと思いますので別に全部取る必要ないです。そのあとチップタイプのソニケーターで粘性がなくなるまでソニケーションしてください。(泡立ちまくったら卓上遠心で1分くらい回してください。ある程度泡は消えます。)その後15C~20Cくらいの温度で12000xg、5~10分くらいで遠心してからS/Nをとってサンプルとします。(通常は、沈殿はほとんどないとおもいます。)蛋白質定量のため、そこからごく少量とって1/10くらいに水で希釈してからBCA法で定量するのが良いかと思います。SDSをふくむのでブラッドフォールド法はこの場合、適切でありません。全部すんだら2MEとBPBを入れて電気泳動に進んで下さい。通常よくやる泳動前の加熱ですが、膜蛋白質ということなので、はじめは加熱あり、なし両方をやってみた方がよいかもしれません。SDS濃度も、もしも上手くいかないときは、通常の2%から3~4%に上げてみるのも良いかもしれません。トランスファーバッファーには最終濃度0.02~0.05%くらいでSDSを入れた方がよいでしょう。



組織でも基本的には同じ方法ですが、組織/bufferの体積比はだいたいの目安ですが、1:20~50くらいにした方がいいです。

(無題) 削除/引用
No.1003-14 - 2008/04/23 (水) 10:33:41 - 困った
追加です。前のlysis bufferと今のを用いたsampleを一緒に流して見ました。前のやつは全くバンドがでず、今のやつはバンドがちゃんとでているものが、今回は中にありました。結論として、bufferが問題だったのではなく、蛋白の抽出に問題があったようです。バンドがでていないやつは、bufferの違いによらずsonicationしているものでした。しすぎだったんでしょうか。

基本的で申し訳ないのですが、蛋白の抽出方法について確認しておきたいと思います。

6wellの場合。
1.PBSでwash2回。
2.lysis buffer100μlでcell scraperを用いながら回収。
3.homogenize or pippeting up and down
4.microfuge
5.回収。

2、3の時にいつも不安になります。PBSで回収してからlysis bufferを加えるというprotocolもありますよね。その方が、沢山回収できるような気がします。

(無題) 削除/引用
No.1003-13 - 2008/04/23 (水) 10:00:28 - 困った
みなさん。ご意見ありがとうございました。

1.lysis bufferを変えた理由と組成。
そもそも、NP-40,NaCl, Tris-HClのみのbufferを研究室の人からもらって使っていました。知識のなさをさらけ出しますと・・・・みたいバンドは出るんですが、非特異的バンドもでて、バックも汚くあまり綺麗でなかったので、抗体の濃度やblocking bufferなど、あれこれ変えてみても駄目だったので、Lysis BufferをEDTAやPPI入りに変えようと思いました。また、論文で綺麗に出している方にprotocolをお聞きしてそれと全く同じ組成のBufferで・・・と思って思い切って変えたのでした。

2.アクチンがでなかった理由

結局ご指摘にあったように、抗体が悪かったようです。二次抗体が実は使えないものだったようで・・・

3.おおさんに教えてもらったCBBを今度やってみるつもりです。実は質問に出した時点で、残った蛋白も一緒に流しておりました。そちらには、よくわからないバンドが出ていました。本当によくわからないんですが。

4.sample bufferにいきなり溶かすというのは、具体的にはどうするんでしょうか。私はラミニ系sample bufferを使っていますができますか。

(無題) 削除/引用
No.1003-12 - 2008/04/22 (火) 17:37:21 - 名無し
actinならファイバーなってるやつだけでなく、可溶性のモノマーも細胞質にけっこうあると思うので、仮にかなり適当な方法でいい加減にlysisやったとしても、細胞が壊れさえすればある程度出てくるから、たとえlysisが不適切であってもWBなら高感度だしバシッと見えるとおもう。組織でも同様。それが見えないということは、Lysisが問題というよりも、トランスファーや検出のところあたり、だいじょうぶかなあ?と思うのですが。検出試薬が劣化してきたとか、抗体が変になってきたとかそういうことではないのかなあとおもう。

lysisについては、特殊な組織や細胞だったら分からないけど。

(無題) 削除/引用
No.1003-11 - 2008/04/22 (火) 17:21:28 - amits
> ところが、これに変えてから

もとは何バッファー使ってたんですか。

(無題) 削除/引用
No.1003-10 - 2008/04/22 (火) 14:05:44 - おお
>[Re:9] -さんは書きました :
> WBだけなのであれば、Sample bufferでいきなり溶かすのはだめですか?
私も基本的にそう思います。でも、今まで検出できていた系から、バッファーをわざわざ今回の組成に変えたようなので、もう少し理由があるように思えます。
実際どうなんでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.1003-9 - 2008/04/22 (火) 12:53:51 - -
WBだけなのであれば、Sample bufferでいきなり溶かすのはだめですか?

(無題) 削除/引用
No.1003-8 - 2008/04/22 (火) 12:39:00 - おお
"1%IGEPAL(NP-40)なら膜は可溶化されていると思いますので"
と申し上げていますので、たいていの膜タンパクは1% NPー40あるいは1% TRITONXー100で溶出されると思います。ただし、万能とはいえませんので、個々のたんぱく質で1度検討を加えるのが望ましいです。あるいは文献を調べたいていの研究者がやっている方法を元にするのがベターです。


NPー40/TRITONXー100は比較的マイルドな界面活性剤です。デオキシコール酸もマイルドな方に入りますが、タンパクの活性や構造という意味では前者と違った作用を示すことがあります。SDSは非常に強力な界面活性剤で単独で用いる時はたいていたんぱく質はその独自の構造を失っていることが多いですが、ある種タンパクや抗体はSDSを含むRIPAバッファーでも大丈夫であったりします。

界面活性剤の選択は目的にもよりますので、一概にデオキシコール酸を加えたから、SDSを加えたからいいとは申し上げられませんがウエスタンで検出だけが目的なら加えてた方がいいだろうと思えます。

その前に、バッファーでかよう化したあとのペレットにタンパクがあるかどうか確認して目的のものがほんとにカヨウ化されてないのかどうか確認するのが先ではないでしょうか。

CBBはゲルの染色にも使われるもので、ゲルの染色のことを申し上げています。別にCBBでなくても、メンブレンにトランスファーしたサンプルを何らかの方法で染めても良いかと思います。
確認できることは2点ほどあります。
タンパク定量は(BCAはあまり経験がないのですが)バッファーなど条件が違えばぶれる可能性があります。同じバッファー条件での比較であればほぼ間違えないでしょうけど、違うバッファーであれば30マイクログラムと出ても違う可能性があります。ですから今までやっていたやり方での30マイクログラムに匹敵するぐらいの量があるかどうかが確認できます。もう一つは何らかの原因でSDSPAGEがあまりきれいに流れてないかもしれません。オーバーロードであったりとかです。ですからゲルのタンパクを染めるか、トランスファーしたあとのタンパクを染めるかして、うまく流れているかどうかとかタンパク量が見積もってたよりも少なかったりはしないかなど見てみればどうですかと言う事です。

(無題) 削除/引用
No.1003-7 - 2008/04/22 (火) 12:01:58 - 困った
訂正です。tritonXを加えると、核内にある不活性型蛋白は検出できても、膜に発現している活性型蛋白を検出できないということはないでしょうか・・という質問でした。

(無題) 削除/引用
No.1003-6 - 2008/04/22 (火) 09:34:47 - 困った
>[Re:5] 7878さんは書きました :
> Coomassie Brilliant Blueの略ですよ。SDS‐PAGE後のゲル染色によく使います。
 ありがとうございます。調べてやってみます。

まだお聞きしたいことがあります。

1.1% sodium deoxycholateと0.1% SDS、また1%tritonXなどは膜蛋白検出でも加えても問題ないものなんでしょうか。

2.ソニケーションは、かけすぎると何か問題あるでしょうか。

CBBは 削除/引用
No.1003-5 - 2008/04/22 (火) 06:41:03 - 7878
Coomassie Brilliant Blueの略ですよ。SDS‐PAGE後のゲル染色によく使います。
クマシーは分子構造の違いで染色とタンパク定量用に分けて使われてます。おおさんがいっているのは、たぶんゲルを染色しろということだと思う。
あと、溶けきらないPMSFはそれ自体もう設定した濃度とは違うと思いますので、気持ち悪いからきちんと溶解させたほうが良いと思いますよ。私はイソプロは使わずにDMSOで溶解してます。

(無題) 削除/引用
No.1003-4 - 2008/04/21 (月) 17:11:27 - 困った
>[Re:3] おおさんは書きました :

CBBというのは、protein concentration mesurementの一種ですか。私はBCAで測っているのですが、濃度は問題ないようでwellには30μg流しています。

あの、isopropanolに溶けきらないPMSFも問題なさそうでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1003-3 - 2008/04/21 (月) 15:37:07 - おお
1%IGEPAL(NP-40)なら膜は可溶化されていると思いますので、ロフトのような構造を取っていたりしない限りは溶出できると思いますが、もちろん細胞が多すぎると問題がありますが培養の細胞ならそんなに問題は起こらないと思います。アクチンの検出についてはちょっと不思議に思います。ウエスタンのシステムがワークしなくなったという可能性は否定できますか?

可溶化後に残るペレットをサンプルバッファーに溶かし流すと可溶化されていないのが原因かどうかはっきりする可能性が高いです。
今まで使っていた溶出方法で得られたライセイトと今回のやつを同時に流して、CBBなどで量的にどうかとか。ウエスタン自身はうまくいっているかとかチェックしていけばいいかと思います。

バッファーについてはほどんど問題ないですね。プロテアーゼインヒビターはロイペプチン、アプロチニン、EDTAなど多種のインヒビターMIXを使うことがおおいです。2ーMEかDTTは入れると差し支えありますか?

可溶化されていないのがはっきりした時点で、バッファーを工夫して行けばいいかと思いますが、RIPAバッファーは人によって成分が違いますね。1%NPー40/TritonXー100にさらにデオキシコール酸またはCHAPS 0.1-0.5%を加えそのうえ0.1%SDSを加える物もあります。

(無題) 削除/引用
No.1003-2 - 2008/04/21 (月) 13:59:02 - a
β-actinすら検出できないってことは、細胞がlysisされていないような気がしますが・・・

1.イムノブロットが目的であれば1% sodium deoxycholateと0.1% SDSもlysis bufferに加えてみるのは?

2.buffer組成を変えれないのなら、10^6-10^7cells/ml程度で可溶化してみる

3.ソニケーションを軽くかけてみる

などです。

膜蛋白の検出 削除/引用
No.1003-1 - 2008/04/21 (月) 10:55:59 - 困った
ASCT2という膜蛋白をWBで検出しようとしています。使うべきLysis Bufferは、RIPA(50mM Tris-HCL, 1%IGEPAL, 150mM NaCl, 1mM EDTA)+PPI(1mM PMSF, 1mMNaF, 1mM activated Na3VO4,protease inhibitor)です。ところが、これに変えてからASCT2どころかβ-actinすら検出できなくなってしまいました。lysis bufferが駄目らしいのはわかりますが、どう改善したらよいかわかりません。
1.RIPAの各溶液は、すべてDDWで溶かして作りました。
2.Tris-HClはTris溶液を作ってからHClを加えながらpHをあわせました。
3.PMSFはisopropanolで溶かしましたが、なかなか溶けにくくすべてを溶か  しきることができません。
4.activated Na3VO4はboilと冷却を2回繰り返しpH10にあわせ、色も黄色から無色透明にしています。

16件 ( 1 〜 16 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を