全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございます。 削除/引用 No.4618-7 - 2007/08/01 (水) 13:29:00 - sandwich みなさま。 色々ご意見ありがとうございます。 その後、自分なりに考えてキット付属の抗原を熱処理してみたり、 キットに付属のlysis bufferを用いるなどして、購入した抗原が うまく認識されるかどうか試してみたのですが、感度は上がりませんでした（涙） 仕事中さま、酒多飲さまのおっしゃるとおり、 2の方法で進めていこうかなと考えたのですが、 実際、傾きは購入した抗原の方では低かったため、 厳密な意味では購入したものの濃度を求めることはできないようです。 8410さまのおっしゃるように、感度は悪いものの直線性はあるので 「購入した抗原の濃度を正しいとすると」という条件付きですが、 なんとかELISAに使えないことはないのかなぁと考えております。 以上のような解釈であってますでしょうか？ 検量線がS字になることは知ってましたが、酒多飲さまの書かれたような 数式だとは知りませんでした。 勉強になりました。ありがとうございます。 ちなみに、感度が悪いというのは125pg/ml以下になると0pg/mlと 同じくらいの吸光度になってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.4618-6 - 2007/07/27 (金) 15:17:52 - 酒多飲 仕事中さんの意見に全面的に１票。 ２が現実的なのでしょうが、ちょっと心配ですね。 エライザの標準曲線（検量線）は ４係数ロジスティック曲線になるのが普通です。 Y = D + (A-D)/(1+(X/C)^B) Yは測定吸光度、Xはタンパク量 Aは最小吸光度、Dは最大吸光度、Cは変曲点をしめすタンパク量 BはS字カーブの曲がり具合を示します。 抗原抗体反応の強さによって B の値が変化するので、 大腸菌リコンビナント抗原を用いた場合、 おそらく B が減少してカーブが緩やかになるのではないかと思います。 もしそうであったとしたら、解決策２は採用しにくいです。 直線回帰した場合でも傾きは異なる可能性はあるでしょう。 たぶん行けるとは思いますが、やってみないとわかりません。

(無題) 削除/引用 No.4618-5 - 2007/07/27 (金) 14:13:58 - 8410 >ただし２の場合はキット付属スタンダードで作成した検量線の >傾きと新規購入抗原で作成した検量線の傾きが同じでないと使 >用できません。 新規購入抗原の値付けし直しが、異なる傾きを同じにするための行為なのだから、検量線が一次関数であるかぎり使用出来きますよね。

この場合は 削除/引用 No.4618-4 - 2007/07/27 (金) 13:09:22 - 仕事中 キット付属スタンダード抗原と新規購入抗原は「別物」と考えたほうがよさそうです。ネイティブとレコンビナントとでは立体構造が異なる場合も多いですから、今回はそのケースなのかもしれません。 （単純に新規購入抗原の濃度が間違っているのかもしれませんが） 対策としては １．キットを販売しているメーカーに問い合わせてスタンダードのみを販売してもらう。 ２．キット付属スタンダード抗原を指標に新規購入抗原の濃度を決定。その数値を基に新規購入抗原をスタンダードとして用いる。 一番安全なのは１ですが、２も何とかなるのではないかと。 ただし２の場合はキット付属スタンダードで作成した検量線の傾きと新規購入抗原で作成した検量線の傾きが同じでないと使用できません。

(無題) 削除/引用 No.4618-3 - 2007/07/27 (金) 12:40:48 - sandwich 酒多飲さま。 ありがとうございます。 キット付属のものは "detergent-disrupted, heat-inactivated viral antigen" と書かれていました。 新しく購入したものは大腸菌に発現させて精製したものだそうです。 キットのものは熱処理をしてあることでエピトープの部分が うまく露出しているのでしょうか？ （どのような条件で熱処理したのかは不明ですが） ちなみに、新たにTriton処理を行わないでやってみたのですが、 同時に行ったTriton処理をしたものと全く変わりませんでした。 このことから、Tritonによる影響は関係なかったのかなと考えています。

(無題) 削除/引用 No.4618-2 - 2007/07/26 (木) 14:42:22 - 酒多飲 キット付属と新規の抗原の間に何か違いはありませんか？ リコンビナントとか Whole virus とか精製品とかホルマリン不活化とか また、 TNX は私の経験では 0.01% でも半分以下になったことがあります。 共有結合プレートを使えば何とかなるのですが。

サンドイッチELISAの自作 削除/引用 No.4618-1 - 2007/07/26 (木) 12:12:44 - sandwich いつもお世話になっております。 現在、経費節約のため、ウイルス抗原のサンドイッチELISAを 構築しようと試みていますがうまくいきません。 ちょっと長くなりますが、方法は以下に示すとおりです。 　１）100mM carbonate buffer (pH9.5)でcapture Abを固相化 (Nunc Maxisorp plate 4°C overnight) 　２）PBS/0.05% Tweenでwash 　３）TBS/1% skim milkでblocking (室温, 2hr) 　４）PBS/0.05% Tweenでwash 　５）DMEM/10% FBSで希釈した抗原をのせ 1/10 volumeの5% Tritonを加える (37°C, 2hr) 　　　(ウイルスの不活化のためにTriton処理を行っています) 　６）PBS/0.05% Tweenでwash 　７）検出抗体をのせる (37°C, 1hr) 　８）PBS/0.05% Tweenでwash 　９）HRP標識2次抗体をのせる (37°C, 1hr) 　１０）PBS/0.05% Tweenでwash 　１１）TMBで発色 　１２）1N HClで発色停止 　１３）プレートリーダーで検出 (450nm) ポジコンとして、以前使っていたKitに付属していたスタンダード抗原を用いていまして、 こちらの方はきれいに発色します。 しかし、新たに購入した抗原を同じ濃度に希釈したときには発色度合いが半分以下です。 これは買った抗原が悪かろうと思い、その会社に問い合わせたところ、 「ウイルス不活化に用いたfinal 0.5%のTritonが抗原抗体反応を阻害するとともに、 固相化の抗体がはがれているのだ」と言われました。 だとしたら、Kitに付属の抗原ではなぜ同じ事が起こらないのか疑問に思っています。 今後大量にELISAを行いたく、Kit付属のものはあまり残っていません。 従って、これがなくなる前に系の立ち上げが成功せねばと思っているのですが、 このような状態だと別の会社から抗原を買うしかないのでしょうか？

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---