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(無題) 削除/引用 No.4612-11 - 2007/09/14 (金) 15:17:05 - hourensou 当方はPet vectorではなく、タカラのP Cold Vectorを使用しています。 このVectorのプロモーターは、コールドショックで機能しますので、通常発現しない蛋白質でも発現します。 His-tagも使えますので、非常に有効。 また、BL21ではなくorigamiやrossetaとかにすると蛋白質が発現することがありますので、是非ご検討ください！

(無題) 削除/引用 No.4612-10 - 2007/08/30 (木) 13:54:20 - ats 逆位反復配列があると、転写終結シグナルとして働くこともあります。 また、RNAの二次（高次）構造が形成されると翻訳効率が落ちることもあります。 100残基程ならin vitroの翻訳システムを利用する手もありそうです。

(無題) 削除/引用 No.4612-9 - 2007/08/06 (月) 21:06:25 - エアロ ありがとうございます。コドン使用頻度については調べました。大腸菌はBL21(DE3)codon plus RILを使用しています。

codon usage 削除/引用 No.4612-8 - 2007/08/04 (土) 01:40:05 - IKA 導入した遺伝子配列に、大腸菌で使用頻度の低いコドンが多く含まれていると、 それが発現しない場合があるということを、文献でみかけたことがあるのを覚えています。 各種のコドン使用頻度は、Webでもデータベースなどで調べられるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4612-7 - 2007/08/03 (金) 15:17:33 - エアロ 様々なアドバイスありがとうございます。 インサートの上流の配列は問題ありませんでした。 ベクターはpET15b(Hisタグ)とpGEX6P-1(GSTタグ)を試しました。 IPTG＋と-の菌体量を比較したことはありません、すいません。 ちなみに発現させようとしている蛋白質がウイルス由来の蛋白質なのですが なにかその辺が関係することはあるのでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.4612-6 - 2007/08/01 (水) 22:15:13 - タンパク野郎 ベクターは何をお使いでしょうか？

大腸菌にとって 削除/引用 No.4612-5 - 2007/08/01 (水) 20:50:48 - 大腸菌嫌い 大腸菌にとって毒性のあるタンパク質ではありませんか？ 以前、毒性のあるタンパク質を発現させたことがあるのですが、当然、IPTGをかけると死に始めます。 このため、発現量はきわめて低く、精製しないと発現しているかどうかわかりませんでした。 もし、発現させようとしているタンパク質に毒性があるようであれば、明らかにIPTG（−）と（＋）で菌体量が異なるので、簡単に見分けることが出来ると思います。

(無題) 削除/引用 No.4612-4 - 2007/07/27 (金) 13:24:59 - ats 動物細胞由来の遺伝子と異なり、大腸菌での翻訳開始には開始Metコドンの約10bp上流にRBS（ribosome binding site、Shine-Dalgarno配列）が必要です。コンセンサスは、AGGAGGですが、このうち少なくとも3bpが必須で、４-5bpほどで十分なようです。 ご存知だとは思いますが、念のため。

(無題) 削除/引用 No.4612-3 - 2007/07/25 (水) 18:36:52 - パンタ インサートのフレームだけでなく、開始コドンの上流の調節領域の配列もOKですか？　知人は、一部配列がゴッソリ抜けてて、発現しなかったと言ってました。

(無題) 削除/引用 No.4612-2 - 2007/07/25 (水) 16:25:15 - ひろ タンパクがインクルージョンボディーにいっているんじゃないですか？？ 一度ペレット分画にタンパクがないか調べてみてください。 もしペレット分画にいっていたら、大腸菌ではなくバキュロの系でタンパクをとるのをおすすめします。

融合蛋白質が発現しない理由 削除/引用 No.4612-1 - 2007/07/25 (水) 13:50:56 - エアロ His-tag融合で100残基程の目的蛋白質を発現させようとしているのですが、どのように条件(IPTG濃度、温度、培養時間)をふってもまったく発現しません。シークエンスでプラスミドにインサートがぴったり入っていることは確認しましたし、変異も入っていませんでした。大腸菌はBL21(DE3)codon plus RILを使っています。 原因や対策など知っていることがありましたら教えていただけないでしょうか。お願いします。

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