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(無題) 削除/引用 No.4601-7 - 2007/07/26 (木) 15:00:05 - カナマイシン >みなさま 私の読み方はだいぶ甘かったようです・・・ ちなみに私は実際には、 （１）WALT様が書かれている「制限酵素の基礎知識」に載っているものは実際より辛めの評価 （２）上記で私が挙げたリンク先のデータは実際より甘めの評価 ととらえて見てました。 じゃあ実際プライマーを頼むとなると・・・ 実際より辛めの評価（１）をアテにした方が成功率は高いですよね。 ただ私の周囲に（１）だけをアテにして神経質になりすぎている方がいたもので、 それを思い出して（２）も挙げてみました。 ということで（２）のリンクは参考までに、ということでご覧ください。 SacIなんかみると、（１）から受ける印象とだいぶ違いますし。 あと先に書いた「この表によればだいたいの酵素は切れるみたい」という表記は 完全に早とちりなので訂正させてください。すみません。みなさまありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4601-6 - 2007/07/26 (木) 11:27:18 - 奴隷 カナマイシンさんの挙げておられる表の脚注にも次のようにありますね。４塩基足すってことは、この表の示しているのは最低でも５塩基加えた場合の効率に相当する可能性があるということになります。 "Base Pairs from End" refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut. Since it has not been demonstrated whether these single-stranded nucleotides contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers. 実際には酵素も定義量の何倍も使う場合も多いですし、10%も切れればサブクローニングなどには実際上は問題無いとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.4601-5 - 2007/07/25 (水) 22:43:46 - そうなの？ さらに、%Cleavage Efficiencyというのも、通常の長いDNA配列の中の同じサイトを切断した場合に対する比率ではなくて、定義量の10倍の酵素を使って切断した場合の切断効率を言っているので、例えばHindIIIの場合には、3nt余分に付いていても、通常（つまりλDNAのHindIIIを切断する場合）に比べて10%以下の切断効率だと読めるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4601-4 - 2007/07/25 (水) 22:38:38 - そうなの？ でも、カナマイシンさんの挙げておられる表は、Base pairs from Endといってもcohesive endの短い方の値が書いてあるので（つまり長い方はさらに+4だったりするので）、産物がbluntになるPCRのケースよりはかなり甘い条件になっていてこのまま適用はできないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4601-3 - 2007/07/25 (水) 22:02:29 - カナマイシン その情報も参考になるんですが、同じ会社（大元はNEBでその日本請負が第一化学）の WEBページにはより実際に近い情報が載ってますよ↓ （私もこのフォーラムで知ったのですが・・・感謝です）。 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_linearized_vector.asp#S なんでカタログに載せないんですかね。次回くらいから載るのかな？ この情報によれば、だいたいの酵素は切れるみたいですね。 あんましアテにしすぎてもいけないんだろうけど。

(無題) 削除/引用 No.4601-2 - 2007/07/25 (水) 19:54:25 - WALT 第一化学の出してる制限酵素の基礎知識に載ってますよ（無料）。 HInd IIIは5'ではにCを３個、3'ではGが３個で（つまり、CCCAAGCTTGGG）で２０時間で７５％切れるそうです。 他の酵素についても載っているので出入りの業者に聞いてみたらどうですか。

HindIIIの切断効率について 削除/引用 No.4601-1 - 2007/07/24 (火) 20:08:38 - hin Hind�Vサイトが配列の末端にあるとき、切れにくいと聞きましたが、どれくらい切れにくいものなのでしょうか？ また、Hind�VサイトをPCR産物の末端につけるときにどれくらい塩基を余分に付加したら切れるようになりますか？

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