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(無題) 削除/引用 No.4594-5 - 2007/07/24 (火) 19:44:33 - GE 皆様、ご返答ありがとうございます。 理論的な面と、経験的な面の両方のお話が伺えて非常に参考になりました。 転写因子の研究はなかなか複雑ですね。 内在性とレポータージーンの実験を組み合わせて、慎重に解釈する必要があるのですね。

(無題) 削除/引用 No.4594-4 - 2007/07/24 (火) 14:12:32 - 奴隷 内在性のＢがあるかぎり、う〜んとさんの仰る効果はレポーターの発現にも及ぶのではないでしょうか。 同様に通りすがりさんの仰るように、転写因子Ａの作用が遺伝子Ｂの発現に与える影響が、直接ではなくて間に何ステップも入っている場合でも、同じことはレポーターの発現でも問題になるはずです。 クロマチンの構造云々というのも、本来の転写制御を見ているのではないわけですから、アーティファクトを助長しているだけのような気がします。 レポーターを使う第一の理由は、mRNAの安定性や翻訳の制御などの転写誘導以外のレベルの制御の可能性を除こうとするものだと習いましたがどうでしょうか。現実的には、レポーターを用いたアッセイの方が手技が簡単であるということが大きいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4594-3 - 2007/07/24 (火) 08:01:27 - 通りすがり >ゲノム上での遺伝子Bの発現を見るのにこしたことはないと思うのですが、こ >のような方法をとるのには何か理由があるのでしょうか？ 実際やるとわかるんですが、分化のmaster regulatorとかstress誘導性とかの一部のグループを除いて、一種類の転写因子とかを過剰発現させても、はっきりいって思うような結果がでないことが多いんですよ。出たとしても非常に微弱で1.5倍から２倍程度の変化とかが多いですね、自分の経験では。 >しかし多くの論文では、遺伝子Bのプロモーターをルシフェラーゼ遺伝子につ >なげて、このプラスミドと転写因子Aを過剰発現させ、ルシフェラーゼの発現 >量をモニターすることで転写因子の作用を見ています。 >このような方法をとるのには何か理由があるのでしょうか？ いろいろな理由があると思いますが 自分でパッと頭に浮かぶのは以下の3つでしょうか。 まずは転写因子Aを発現させて結果的に遺伝子BのmRNAが増大したというデータが得られたしても、それがAによる未知の因子Cなどを介している可能性が否定できないからです。この場合Cが活性化因子であれば、Bを抑制する因子もあるでしょうし、CとBの間に、さらに未知のDやEなどが関与してきてしまう可能性もあります。 あとは、ほとんどのin vivoでの場合、遺伝子というのは一種類の転写因子による制御を受けているわけでなく様々な複数の因子の制御をうけており、さらにこれらは核内で複合体を形成したりして共役的に活性化したりすることが多いので一種類の転写因子を過剰発現させただけで歯発現はそれほど変化しないことが多いのです。逆にseqeusterされて遺伝子Bの発現が減少したりすることもまれにあります。 最後はもっと現実的に直面する問題ですが、vivoでのDNAというのはクロマチンに覆われているため転写因子が必ずしもDNAにアクセスできるといは限らないわけで、細胞の種類によってはいくらAを過剰発現させてもBは無変化ということは非常に多く認められるはずです。 Reproterなどを使用するのはtransientにいれた場合すくなくとも短時間ではクロマチンなどの構造が完全には作られないため転写因子がアクセスしやすく、またreporterの活性化がつなげたB由来のcisのエレメントと過剰発現させたAの transの効果とを比較的directに述べやすいからです。

(無題) 削除/引用 No.4594-2 - 2007/07/24 (火) 00:23:17 - う〜んと 過剰に発現した遺伝子Bの産物が、自身のプロモータ活性を制御することがあるからでは？

転写因子の解析 削除/引用 No.4594-1 - 2007/07/23 (月) 22:35:19 - GE 最近転写因子について研究しているのですが、ふと思ったことがあり書き込みました。 ある転写因子Aが遺伝子Bの転写を活性化させるとします。 これを確認する方法として、転写因子Aをプラスミド等で過剰発現させて、遺伝子Bの転写量をmRNAで確認すればいいと思います。 しかし多くの論文では、遺伝子Bのプロモーターをルシフェラーゼ遺伝子につなげて、このプラスミドと転写因子Aを過剰発現させ、ルシフェラーゼの発現量をモニターすることで転写因子の作用を見ています。 mutation等でプロモーター上の転写因子結合部位を同定するのは別として、ただ転写の活性化を見るだけの場合もこの方法を使っている論文を多く見かけます。ゲノム上での遺伝子Bの発現を見るのにこしたことはないと思うのですが、このような方法をとるのには何か理由があるのでしょうか？

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