全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4581-12 - 2007/07/26 (木) 15:16:48 - ひとみ センターさん。ありがとうございます。勉強不足で教えていただきたいのですが、RIPAバッファーは核タンパクを見たい時に使うものなんですか？それから一般的なlysisバッファーというと具体的にはどういうものになるんでしょうか？初心者丸出しですみませーん。よろしくお願いします。

上清も検出しないとだめですか？ 削除/引用 No.4581-11 - 2007/07/26 (木) 13:49:55 - センター 通常リガンドのような分泌タンパクは培養上清に放出されますが、細胞のみを可溶化しただけでも検出は可能かと思われます。タンパクの強制発現下でなく内在性のタンパクを検出していて、タンパク濃度が低いのであれば、２４穴ではなくもっと大きなplate(例えば6 cm や１０cm plate）で培養して500マイクロリットルくらい（更に濃いサンプルを調整したいのであれば、もっと減らしても良いかと思います）のlysis buufferでlysisしてみてください。このサンプルのうち出来るだけ多くアプライすれば見れるかもしれません。目的のタンパクが核ではなく細胞内に存在しているのであれば、RIPAで行なう必要はありませんので、一般的なlysis bufferで対応できるかと思いますので、皆さんの投稿でのStrataCleanも使えるかもしれません。良い抗体があるのであれば、細胞にしろ、上清にしろIPは良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4581-10 - 2007/07/26 (木) 06:13:15 - ひとみ - 奴隷さん ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4581-9 - 2007/07/23 (月) 17:57:59 - 奴隷 １％のデオキシコール酸で結合が妨げられるタンパク質があるようですので、RIPAとは使えないようですね。 Anal Biochem 250: 257-260 (1997)

(無題) 削除/引用 No.4581-8 - 2007/07/23 (月) 17:42:52 - 奴隷 すみません、分かりません。試しにやってみるか、または、培養上清からの回収にはよく使われているようですので、上清からはこうやって集めて、細胞から調製したlysateと合わせるのはどうですか。

(無題) 削除/引用 No.4581-7 - 2007/07/23 (月) 17:13:12 - エリカではなくひとみ みなさん、有益な情報をありがとうございます。 奴隷さん、このStrataCleanはRIPAバッファーでDTTの存在下でも workしますでしょうか？ご存知であれば、ご教示ください。

(無題) 削除/引用 No.4581-6 - 2007/07/23 (月) 17:10:17 - エリカ みなさん、有益な情報をありがとうございます。 奴隷さん、このStrataCleanはRIPAバッファーでDTTの存在下でも workしますでしょうか？ご存知であれば、ご教示ください。

(無題) 削除/引用 No.4581-5 - 2007/07/21 (土) 21:42:35 - 奴隷 Stratageneが提供しているプロトコルがありました。 http://www.stratagene.com/pdf/protocols/StrataCleanProteinConc.pdf

(無題) 削除/引用 No.4581-4 - 2007/07/21 (土) 21:40:19 - 奴隷 DNAサンプルからPhOH抽出なしで除タンパク質を行うためのStrataCleanという製品を使って、SDS-PAGE用にタンパク質濃縮を簡便に行うトリックがあります。 Googleで「strataclean sds-page」で検索すると用例が沢山見つかると思います。

(無題) 削除/引用 No.4581-3 - 2007/07/21 (土) 21:02:35 - 〜 IPでもいいのでは 発現量が少ないタンパク質でよく使われています。

(無題) 削除/引用 No.4581-2 - 2007/07/21 (土) 16:32:39 - 通りすがり タンパクを濃縮してボリュームを少なくして からsample bufferなどに溶解してapplyするというのが定法でしょうね。 有る程度お金に余裕があるならカラムなどを使えばよいと思います。 "protein" "concentration" "column"などをkeywordにgoogleででも探せばいっぱいでてくると思います。使い方は各社のmanualを参考にすればよいです。 ただ24wellでそれぞれのwell間の量比を比較したりするのが目的なら 結構面倒だし高くつくでしょうね。 お金に余裕が無かったり、現実的に多くの人がやってるのをしたいならば いろんなタンパクの沈殿法(TCAとかアセトンとか)などをやってみてください。 生化学系の実験書の本などを読んでみれば どれにでもやり方は載ってるので参考にしてみてください。

westernblotのsample　volume 削除/引用 No.4581-1 - 2007/07/21 (土) 15:36:34 - ひとみ 初心者です。westernblotについてなのですが、24穴plateに細胞をまいて 500ulmediumで培養しています。あるタンパクをwesternblotで検出したいのですがこのタンパクは細胞中と上清中の両方に存在し、発現量が少ないのでwestern　1レーンにつき24well-1穴分の細胞と上清が必要です。２XRIPAバッファーをwellに加えると1mlのsampleができるのですが、これを1レーンにロードしないといけません。こんなときどうやってロードすればいいのでしょうか？何かよい方法があれば教えてください。 お願いします。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---