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ピペットマン 削除/引用 No.4573-15 - 2007/08/02 (木) 18:43:57 - 999 ご意見ありがとうございました。 別の人間がピペットマンを変え、プライマーの調合（市販のものを PCRの最適濃度に希釈）をし直し、アニーリング温度を４８℃で行ったところ、 ネガティブコントロールに出ていたバンドが消えました。 これまでのコンタミの原因は、ピペットマンにDNAがついていて、 数回に一回のピペッティングで入っていたのだと思います。 そして、プライマーを希釈する際、たまたまDNAがコンタミしてしまったと思います。 その希釈したプライマーでPCRを行っていたことがネガティブコントロールに出ていたバンド の原因だったと思います。 これまでご意見を下さった方々、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4573-14 - 2007/07/30 (月) 17:33:59 - 999 ご意見ありがとうございます。現在は電気泳動、DNA抽出、PCRの調合を 全て同じ部屋の同じ場所で行っていました。もし、部屋の空気が汚染されて いるとすると、たとえ試薬を新しくしたとしても、コんタミする 可能性は高いと考えられますね。 ここでのご意見通り、10パーセントアクリルアミドゲルでPCR産物を泳動したところ、 ポジティブコントロールと同じバンドが出ました。よって 非特異バンドではないことを確信しました。 新しい試薬で、クリーンベンチで再度PCRを行いたいと思います。

経験上の注意点 削除/引用 No.4573-13 - 2007/07/27 (金) 13:01:44 - ats 私たちの研究室では、繰り返し行うPCRの場合、PCR negative controlなのにpositiveになるような問題が発生しないようにするため、PCR mixを調製する部屋（UVの照射可能なクリーンベンチが望ましい）、電気泳動する部屋を分けています。すなわちPCR mixを調製するピペットマン、チップ(filter付きが望ましい）も電気泳動用とは別となります。もちろん、チップ、ピペットマン、チューブ、試薬類を開ける場所も気をつけています。電気泳動を行った泳動bufferやゲルを廃棄するときにミストになってその部屋（の空気、塵？、エアコン？）がPCR産物で汚染されるようです。部屋の汚染は、その部屋で空のチューブの蓋をあけておいてから、汚染のないクリーンベンチでPCR mixを分注し反応させると判定できます。 subcloningなどで用いる、その場限りのPCRには、気を使っていません。 RNaseの汚染も同じようなものらしいです。お気をつけ下さい。

(無題) 削除/引用 No.4573-12 - 2007/07/25 (水) 23:32:06 - ryo 可能性はありますが、弱いです。 cut checkかダイレクトシークエンスを行いましょう。

アニーリング温度について 削除/引用 No.4573-11 - 2007/07/25 (水) 15:50:09 - 999 アニーリング温度を三度上げてみると、 ネガティブコントロールに出ていたバンドが、明らかに ポジティブコントロールのバンドよりも薄くなっていました。 これによって、これまでネガティブに出ていたバンドが 非特異産物であったと解釈していいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4573-10 - 2007/07/20 (金) 17:27:52 - 〜 ポジコンやサンプルがどこかにコンタミした可能性が高いと思いますが、 念のため、PAGEで移動度を見たり、 ネガコンで増えたバンドをシーケンスしてみてはいかがでしょうか。 前に、ネガコンが増えるようになったと思っていたら、 非特異にほぼ同じサイズのバンドが増えるようになっていて、 PAGEでは別の位置のバンドになったことがあります。 (10bpくらいの違いだったので、AGEでは気づきませんでした)

(無題) 削除/引用 No.4573-9 - 2007/07/20 (金) 16:35:05 - 999 >[Re:6] Tさんは書きました : > 機械によって温度の上げ下げにかかる時間も変わってくるので > 最適化条件が変わるという話を聞いたことはありますね。 アニーリング温度を一度づつ上げて見ようと思います。 確かに温度の上がり方も異なるでしょうし、機械が かわったことで、反応液の容量が減ったのでその影響も あるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4573-8 - 2007/07/20 (金) 16:28:17 - 999 UV照射はすぐに出来る対処法ですので試してみます。 一度ピペットマンを疑って、先をエタノールと水で洗ってみましたが 改善されませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4573-7 - 2007/07/20 (金) 15:56:30 - ryo PCRは感度が非常に高いので、40サイクル回したりすると、場合によっては数コピーのDNAを検出してしまいます。 ですので、どれだけ気を付けていても、ピペットマンや周りの器具から、DNAがミストとなってコンタミすることは良くあります。こういった現象はキャリーオーバーと呼ばれており、一度起こってしまうとなかなか改善されないものです。 昔、これが起こった時は、試薬を変えたりするだけではだめで、用いる器具を全てUV照射し、8連チューブを用いずに0.2mlのsingle tubeを用い、クリーンベンチ内で操作することで解決できました。

(無題) 削除/引用 No.4573-6 - 2007/07/20 (金) 14:34:25 - T 機械によって温度の上げ下げにかかる時間も変わってくるので 最適化条件が変わるという話を聞いたことはありますね。

(無題) 削除/引用 No.4573-5 - 2007/07/20 (金) 14:09:06 - 999 確かに機械を変えても最適化条件は変えていません。 機械を変えることによって、非特異産物が増えることは あるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4573-4 - 2007/07/20 (金) 14:06:38 - 999 早速の返信ありがとうございます。試薬を変えたときに プライマーも新しく買い替えました。 確かに８レーンチューブはふたを開けるときに中の液体が 飛び出しそうです。しかし、PCR反応液を作り、８レーン チューブに分けてから、DNAサンプルを入れるようにしているので 問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.4573-3 - 2007/07/20 (金) 14:04:48 - S 機械を変えてから、改めて条件は最適化されましたか？ 8連ではないチューブを使うのはどうでしょう。 大量にやる場合大変ですが、単独の方がコンタミのリスクが減ります。

(無題) 削除/引用 No.4573-2 - 2007/07/20 (金) 13:45:41 - ryo プライマーにPCR産物がコンタミしているのでは？ 8連チューブはふたを開ける時にPCR productが周りに飛び散りやすい気がします。

PCRのコンタミ 削除/引用 No.4573-1 - 2007/07/20 (金) 13:40:57 - 999 １ヶ月前からPCRの機械を変えました。それに伴って チューブも0.５ミリリットルチューブから、０．２ミリ リットルチューブ（８レーンチューブ）にかわりました。 その頃からですが、PCRのネガティブコントロールに バンドが出ます。しかもポジティブコントロールと 同じ所にです。サイズは１１０bpあたりです。コンタミ を疑い、全ての試薬を変え、水も変えました。 サンプルに一切触らず、水でPCR を行ってもしっかりバンドが出てしまいます。 プライマーの重合を疑い、フォワードと、リバース だけでPCRを試みましたが、１１０bpあたりには バンドが出ません。 解決するにはどのような手段があるでしょうか？

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