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(無題) 削除/引用 No.4569-4 - 2007/07/21 (土) 21:31:57 - 弘法 baitの毒性というわけではなさそうですね。 プラスミドを持たない空のAH109にプラスミドを形質転換する場合と、baitを持ったAH109にプラスミドを形質転換する場合では、前培養の培地が違うなど同じ条件とはいかないので、効率が下がったのはそのせいではないですか？例えばbaitとしてp53を導入してあるAH109の場合の形質転換効率は十分に高いのに、ご自分のbaitではぐっと落ちるということは確認されていますか？ また、効率が10倍に改善されたということは、3x10^5/ug library DNAということになりますが、この値は決して悪いものではないと思います。10ugも使えば300万クローンをスクリーニングできるんだし、実際上は十分でしょう。 プラスミドの構造がdeletionなどで変わってしまう原因ですが、形質転換という操作自体がmutagenicなところがあるようです。ssDNAもいっぱい入れているので短い相同配列を介した組換えも活性化されるでしょうし、それに限らず非相同組換えの頻度も上がるのではないでしょうか。ケースバイケースではっきりしたことはわからないのだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.4569-3 - 2007/07/21 (土) 00:31:45 - AH109 コメントありがとうございます！ 確かにbaitの毒性が考えられるような遺伝子で、通常哺乳類細胞内ではごく低レベルの発現に押さえられています。しかし、p53をbaitとして持たせた株と比較しても生育スピードには変化ありません。 ひとつ、いろいろ検索して探しだした条件で、今日出た検討結果なのですが、heatshockを推奨15分のところを70分で処理するとtransformの効率が10倍くらい上昇することがわかりました。 しかし、通常の方法でも10倍以上の効率でtransformできるはずなので、根本を解決したということではないのですが、当面この方法を採用してみようかと思っています。 生育スピードには影響しないものの、transform効率には影響するってことはあるのでしょうか？？ 毒性がありそうな因子なので、ご指摘いただいたようにdeletion等が起きている可能性があるような気がしてきました。 酵母は相同組み換えが起きやすいと聞きましたが、その関連で導入したベクターのrearrangementが起きやすいということでしょうか？ よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4569-2 - 2007/07/20 (金) 11:09:41 - 弘法 baitのプラスミドが酵母の生育に影響しているということはありませんか。具体的には、AH109にbaitのプラスミドとベクターとをそれそれ形質転換した株の生育を比較して、bait＜ベクターとなるということです。こういうbaitを持った株は形質転換効率が著しく落ちることがあります。baitのデザインを変えるか、baitのプラスミドとして発現量の低いものを選ぶかすれば改善することがあります。 re-TFで1/3しか再現しないということはままあります。そのためのre-TFテストだということだと思います。どうしてそうなるかはケースバイケースですが、上に述べたようにbaitが酵母の生育に影響するような場合には、baitプラスミドのdeletionなどが起こって、それだけで転写を活性化してしまうような形のものができてしまうということも考えられます。

Y2Hのトラブル 削除/引用 No.4569-1 - 2007/07/19 (木) 18:35:59 - AH109 こんにちは 現在AH109株を使ってY2Hしているものです。 トラブルは大きく2つあります。 まず、トランスフォームの効率が悪いことです。baitを持たせたAH109に対してlibrary plasmidをtransformしたのですが、この場合効率が3x10^4くらいに落ちてしまいます。その前にwtのAH109にtransformしたときには1x10^5出ていました。本来ならばこの段階で1x10^6欲しいところですが。。。transformを改善すべく最近nature protocolに出た方法を参考にしています。(DMSOなしの方法です。） そして、悪いながらもlibraryをtransformしてみますと、SD/-TrpLeuHis培地で5x10^4あたりで20コロニー近く生えてきてしまいました。このコロニーを-TrpLeuHisAde培地に塗ると2/3くらいがさらに生えてきてしまい、さらにplasmidを回収してre-transformすると1／3くらいしか-TrpLeuHisAdeを再現出来ませんでした。。。 いったいどのような原因が考えられるのか、もしご存じの方がいらっしゃいましたらアドバイスいただけると幸いです。宜しくお願い致します。

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