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(無題) 削除/引用 No.4554-11 - 2007/07/21 (土) 22:23:24 - カナマイシン >デングラ様 ご回答ありがとうございます。 確かにあれだけ塩を入れたら塩析しますよね・・・ しかし、そこにエチブロを入れた瞬間にいきなり出てくるのがなかなかフシギな感覚です。 アルカリ法×２はこちらもよく採用しております。 今回もやったんですが・・・。量を稼ごうとしてかなり手荒にやった感があるので、 ２回目のアルカリ法では除けないような細かいクロモ断片が多く残存したかもしれません。 次回、もう少し検討しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4554-10 - 2007/07/20 (金) 15:35:14 - デングラ CsClとEtBrを入れた時点で沈殿が出てくるのは塩析されたタンパク質にEtBrが吸着されたものだと思います。この時点で一度遠心して、上清だけを超遠心に掛けるようにしないと、バーチカルやセミバーチカルのローターだとバンドが乱れてしまいます。 また、バクテリアの染色体DNAの持ち込みが多くてそのせいでプラスミドのバンドとつながってしまう経験をしたことがあります。DNAの調製法がアルカリ法なのであれば、最初のアルコール沈殿物を溶かして、再度アルカリ法の処理を行うとプラスミドが濃縮されました。

(無題) 削除/引用 No.4554-9 - 2007/07/19 (木) 21:50:53 - カナマイシン >アシタカ様 EtBrは結構入れてるつもりなんですが、かなり大スケールから始めているために クロモの量がそれを上回ってしまっているかもしれませんね・・・ ものの本に「かつてはたくさん入れるのが主流だったが、 最近ではDNAに結合しないエチブロがバックグラウンドとして働くのを嫌い 少なめの傾向である」ということを書いてあったので減らしてみたのですが 裏目だったかもしれません。 ちなみに CsCl 入れて 3.5 ml程度のサンプルに対して 10 mg/ml EtBrを100 ul 入れてます。 今回はなかったんですが、CsClとEtBr入れた後にたまにでてくるあの不純物、 なんなんですかね・・・。多糖？？ >T様 理解できました。 盲目的に「速いことはいいことだ」→「速ければ分離もいいはず」なんて 恥ずかしいことに思い込んでました・・・ 目からウロコです。70 krpm、今度試してみます。

(無題) 削除/引用 No.4554-8 - 2007/07/18 (水) 16:36:42 - Ｔ ページ B-4 に書いてあるのがまさしく私の書いた内容です。 回転数を上げるほど傾きがきつくなっているのがお分かりだと思います。 縦軸が比重、横軸が距離なので、傾きが寝ているほど僅かな比重の違いが大きな位置の違いに反映されるということになります。

EtBrは？ 削除/引用 No.4554-7 - 2007/07/18 (水) 16:30:39 - アシタカ EtBrは充分量入っていますか？　濃度どのくらいですか？ 原理を考えれば、過剰量入っていないとクロモソームと プラスミドの分離が悪いことになります。 またCsClとEtBrを加えた時に、多量に沈殿物が出るようですと そちらにEtBrを取られてしまっている可能性もあります。

追記 削除/引用 No.4554-6 - 2007/07/18 (水) 13:55:02 - カナマイシン >a様 どうやらCsCl濃度を変えて重層する方法があるようですね。 本当に分離で困ったら試してみようと思います。 精製２回、というのは、１回目で大雑把にバンドの部分をとってきて、 もう１回長遠心、という感じでよろしいのでしょうか？ >デングラ様 有用な情報をありがとうございます。 多糖はかなり多いことで知られているみたいなので、 前述通りCTABはすぐにでもやってみようと思います。 >T様 たぶんpdfファイルを読み解くとそういうことが書いてあるんでしょうね。 まだ解読に至ってませんが・・・ ２ステップの遠心、試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4554-5 - 2007/07/18 (水) 13:40:43 - カナマイシン >みなさま 自己解決で申し訳ありませんが、以下のようなpdfをみつけました。 http://argiope.bti.cornell.edu/manuals/centrifuges/Beckman_Rotors_Tubes_CD_2003/TLRim.pdf このページのB-3なりB-4あたりを見れば濃度と分離の関係がわかってきそうなのですが （後で解読してみます）、とりあえず上記ページ発見前に見切り発車で仕掛けてしまいました。 サンプルのmlに対し、 等量、1.1 倍、1.2 倍 の g CsClを入れて 100,000 rpm, 12 h 遠心しました。 結果・・・バンドの位置は変わりました。 しかし分離しないんです。 というかクロモに対してプラスミドが少なすぎて見えないのかも？？ もう一度慎重めにサンプル調製しつつ、デングラさんのおっしゃるように CTAB沈殿を検討しようと思います。 ちなみに上記 3 条件では1.1 倍がやはりいちばんちょうどいい位置に バンド（多分クロモだけど）がきました。 ローター条件等にあわせ、やはり所属研究室で最適化されているようです。よかったよかった。

(無題) 削除/引用 No.4554-4 - 2007/07/18 (水) 11:23:08 - Ｔ CsCl の濃度ではなく、遠心の条件が問題だと思います。 高速で遠心すれば濃度勾配はきつくなるので、バンドはシャープになりますがバンド間の距離は縮まります。分離を良くしたいのであれば、比較的低速で長時間遠心するといいでしょう。 私は TLA100.2 ローターを使って、急ぐ時は１０万回転４〜５時間、分離を良くしたい時は７万回転オーバーナイトなどと使い分けていました。１０万回転で何時間か廻してから７万回転に変えれば時間を節約することもできます。

(無題) 削除/引用 No.4554-3 - 2007/07/18 (水) 11:02:48 - デングラ 今お使いの条件でプラスミドのバンドがチューブの高さのほぼ中央に来るなら、その条件でＯＫということだと思います。セシウム濃度を変えても、バンディングする高さが変わるだけで分離の成否には関係ないのではないでしょうか。 DNAとほぼ同じ密度に来る物質が混在すると分離が悪くなるということはあると思われます。多糖類などはその可能性があると思います。溶菌させる前に一度菌体をSTEで洗うと少しはマシかもしれません。また、DNAを一度、CTAB沈殿すると多糖類が除けるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4554-2 - 2007/07/18 (水) 09:59:58 - a 以前大腸菌からとっていたときには、CsCl/EtBr密度勾配遠心で1回精製したものを、さらにCsCl/EtBr密度勾配遠心にかけていました。 あと、チューブにサンプルを入れるときにCsClの濃度を2層にして入れていたこともありました（昔のはなしで詳細は覚えていませんが・・・）。わかりましたら、ここに書き込みます。 中途半端な情報で申し訳ありません。

CsCl/EtBr密度勾配遠心時のCsCl濃度 削除/引用 No.4554-1 - 2007/07/16 (月) 18:54:59 - カナマイシン きれいなプラスミドを得るべく、よくCsCl/EtBr密度勾配遠心を行います。 しかし、クロモソームとプラスミドの分離があまり良くない「場合が」あります。 大腸菌ではなくもっと汚い菌（多糖等が多い）でやる場合に特に調子が悪いです。 さて、分離を決めるのは塩化セシウム濃度であると思っているのですが、 クロモソームとプラスミドの分離に最適な濃度はどれくらいなんでしょうか？ 私は天下り的に 1.12 g /mlサンプル としていたのですが、 ネット上の記述では 1 g/mlサンプルだったり 1.2 g/mlサンプルだったりしています。 どれが最適なのでしょうか？ またそういった原理に詳しい原著論文や実験書をご存知の方、教えていただけると幸いです。 また、分離を妨げる物質等ご存知の方はその情報もぜひお願いいたします。

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