BioTechnicalフォーラム [大腸菌培養上清分泌蛋白質について]

大腸菌培養上清分泌蛋白質について

No.4553-TOPIC - 2007/07/16 (月) 15:40:56 - 分泌系

現在、大腸菌の培養上清に分泌する蛋白質の精製を行っています。
バッチ法でNi-NTA樹脂でアフィニティー精製を行うと問題なく精製できるのですが、プレパックカラムによる同様のカラム精製を行うとほぼ素通りしてしまいます。
流速等を変えたりしたのですが、変化なく素通りしてしまいます。
その蛋白質は他のカラムによる精製が可能なので、確認したところ発現も確認でき、精製も上手くいきました。

蛋白質の種類によってそのような現象がおきるのか？と思い、違う蛋白質で試してみたところ、やはり素通りしているようです。

大腸菌の培養上清にはNi-NTA樹脂に結合するのを阻害するような物質が存在しているのでしょうか？　バッチでは少量（250ｍｌ）カラムでは大量（6Ｌ）の培養量の違いあるのですが、原因がわかりません。

こういった事に関して知見がある方がいらしたら、ご教授アドバイスお願いいたします。
　

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(無題)

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No.4553-10 - 2007/07/21 (土) 00:58:37 - aaa

僕も同様の経験があります。

その時は、培地（ＬＢ）を硫安沈殿-可溶化-透析の後でカラムにかけると大丈夫でした。

バッファー交換

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No.4553-9 - 2007/07/20 (金) 13:02:58 - ういちむ

蛋白質を製造しているものですが、製造手法としてタンジェンシャルフローによる膜での濃縮希釈による方法をよく利用いたします。
小スケールまで可能ですので、関心あればもう少し詳しく記載しますが、、。

(無題)

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No.4553-8 - 2007/07/17 (火) 19:15:35 - a

>カラムにロードするとおそらく最初から素通りしているような
>感じだと見受けられます。
そうですか、small scaleで成功するのは謎ですね。

バッチで精製した蛋白をプレパックカラムに通すと結合しますか？
もしかすると、プレパックカラムが駄目になっている可能性はありませんか？

培地そのものを硫安沈殿したことないのでわかりませんが、ヒスタグ万歳さんが書かれたように最も簡単なのは硫安ですかね。

あと、培地をM9培地にしてみるとか（発現量が落ちるかも知れませんが）。

大腸菌培養上清分泌蛋白質について

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No.4553-7 - 2007/07/17 (火) 13:40:48 - 分泌系

追伸、書き忘れていました。

カラムにロードするとおそらく最初から素通りしているような
感じだと見受けられます。
あくまでUVでモニタリングしているだけですが、素通りのフラクションには
目的の産物以外にはバンドが見られないので、最初からスルーしている可能性が考えられます。

大腸菌培養上清分泌蛋白質について

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No.4553-6 - 2007/07/17 (火) 13:38:37 - 分泌系

書き込みありがとうございます。
そういった可能性もありますよね。

大量にロードすると何らかの阻害が起きる可能性もありますね。
やはりここはバッファー交換などしないといけないのでしょうが、

大量の培養上清を効率よく交換する手法などがあればいいのですが
現在のところ、思いつかなくて悩んでいます。

(無題)

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No.4553-5 - 2007/07/16 (月) 20:23:18 - ヒスタグ万歳

上清からの精製については余り詳しくないのですが
お役に立てれば幸いです。

　カラムでうまくいかない理由は良く分かりませんが、
少量のバッチ法ではうまくいくとの事ですので、
やはり培地の持込が余り良くないのかもしれませんね。

　面倒かもしれませんが、
一度硫安沈殿などしてから、
適当なバッファーに溶解するなどして
培地を除いてみたらうまくいくかも知れません。

(無題)

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No.4553-4 - 2007/07/16 (月) 18:45:57 - a

キレート樹脂ではありませんが、以前イオン交換で結合容量をオーバーするまでロードしたところ、結合していた蛋白質が突然全て出きました。樹脂の結合キャパを越えるのが問題かも知れません。
ロード中、はじめからスルーしてきますか？

あと、私は培養細胞の上清から精製していましたが、培養後pHが酸性になりますので、上清にリン酸バッファー（pH7.5）を加えてから、キレート樹脂にロードしていました。

培地中に阻害因子が存在するのかはわかりませんが、small scaleで上手くいくのであれば、これについては問題ないのかなあと思います。

とりあえず、参考までに。

大腸菌培養上清分泌蛋白質について

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No.4553-3 - 2007/07/16 (月) 17:21:36 - 分泌系

書き込みありがとうございます。情報不足で申し訳ありませんでした。

詳細を記載させていただきます。
１．Hisタグ蛋白の精製ですか？それともHisリッチ蛋白の精製ですか？
　Hisタグ蛋白質の精製です。タグを目的蛋白質のＣ末端側に付加させています。

２．カラムにロードしているのは培養上清ですか？
　培養上清をフィルター濾過したものをロードしています。

３．バッチでは何モルのImidazoleで溶出されてきましたか？
　バッチでは集濃度500ｍＭのImidazoleにて溶出しています。吸着洗浄は
集濃度20ｍＭのImidazoleで行っています。

４．バッチではどれ位の収量でしたか？
　バッチでの収量は約10mg/Lの収量となっています。

５．培地の組成は何ですか？pHも含めて
　培地は基本的なLB培地(pH7.0)です。

以上が基本的な情報となります。
まだ何か足りませんでしたらご指摘お願いいたします。

(無題)

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No.4553-2 - 2007/07/16 (月) 17:06:09 - a

6Lとは大量ですね。
詳細がわからないのでもう少し詳しく書いていただけますでしょうか。

１．Hisタグ蛋白の精製ですか？それともHisリッチ蛋白の精製ですか？
２．カラムにロードしているのは培養上清ですか？
３．バッチでは何モルのImidazoleで溶出されてきましたか？
４．バッチではどれ位の収量でしたか？
５．培地の組成は何ですか？pHも含めて

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No.4553-1 - 2007/07/16 (月) 15:40:56 - 分泌系

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