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non-RI southern トピック削除
No.4547-TOPIC - 2007/07/14 (土) 17:22:31 - skawasa
今度genomic southernを行います。

biotin High primeでランダムラベルしたプローブ（ゲル切り出し精製した500bpのPCR産物1マイクログラムを鋳型にしました）を使って10マイクログラムのゲノム（制限酵素処理）に対してハイブリしようと思っています。non-RIのサザンは感度が良くないと聞きますが、ご経験のある方はこの系で感度が十分かどうか教えて頂けますでしょうか？ちなみにターゲットはduploid genomeあたり１か２コピーと推察されます。ランダムラベルだからコピーあたりのシグナルは高いとやや楽観しているのですが。
　
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(無題) 削除/引用
No.4547-9 - 2007/07/18 (水) 13:21:59 - skawasa
一産婦人科医さま。レスありがとうございます。

頑張ってみます。本当にいろいろ助言頂きありがとうございました。

ご健闘をお祈りいたします。 削除/引用
No.4547-8 - 2007/07/18 (水) 12:09:02 - 一産婦人科医
KPL社のラベリングキットを使っています。http://www.kpl.com/catalog/productdetail.cfm?Catalog_ID=17&Category_ID=465&Product_ID=531

＞プローブの長さはどのくらいにしておられますか？
大体500未満ですね、それでもイントロンサザンだとむごたらしいスメアーになることもあるので、さらに短くしたりもします、がその場合感度が落ちるのが痛いところです。

＞また４種のプローブというのは、作成場所を4箇所選ぶと言うことですよね。
その通りです。

ありがとうございます 削除/引用
No.4547-7 - 2007/07/18 (水) 10:20:51 - skawasa
一産婦人科医さま。レスありがとうございます。

PCRで作成するのですね。そのときは、in vitro transcriptionなどでやるように1:4くらいでdCTPに混ぜるようにするのか、あるいはbiotin-dCTP単独かどちらですか？プローブの長さはどのくらいにしておられますか？また４種のプローブというのは、作成場所を4箇所選ぶと言うことですよね。

質問ばかりですいません。

プローブはＰＣＲで作ります 削除/引用
No.4547-6 - 2007/07/18 (水) 01:35:06 - 一産婦人科医
プローブはbiotin-dCTP入りのＰＣＲで作ります。

洗浄条件は
2ＸＳＳＰＥ、ＲＴ、15ｍ
2ＸＳＳＰＥ、55、15ｍ
0.2ＸＳＳＰＥ、55、15ｍ
0.2ＸＳＳＰＥ、55、15ｍ
でやります。

プローブは最低４個は同時に試します。
スメったりラダったりする時は、洗いの条件を変えてもあまり報われないのでプローブを変えます。

洗いの最中にシグナルが確認できるので基本的に私はＲＩでしかやりません。32Ｐが直ぐ手元に無いときなどはbiotinを使っています。

ありがとうございます 削除/引用
No.4547-5 - 2007/07/17 (火) 12:18:31 - skawasa
一産婦人科医さま。レスありがとうございます。

ちなみに一産婦人科医さまもプローブはランダムラベルのbiotinですか、それともDIGですか？また洗浄条件はどうしてられますか？ご教授願えれば幸いです。

5 ugのマウスゲノム 削除/引用
No.4547-4 - 2007/07/17 (火) 00:28:00 - 一産婦人科医
でも普通に検出できます。

(無題) 削除/引用
No.4547-3 - 2007/07/16 (月) 17:06:56 - カナマイシン
ビオチンで検出ってそんなに高感度でしたっけ？
↑ケチをつけるわけではなく、知らない。

いまちょっとネットで調べたのですが、いい記述が見つかりません。
RIとDIGは現在では同等の感度と聞いており、実際にサザン等やってみても
まあそんなもんかな、という感想なのですが。
そして 10 ugのゲノムというのは私自身がいつもDIGでやるのと同じ量です。

要は、ビオチン検出がDIG検出と同等であれば問題ないと思うのですが・・・

その量で十分です 削除/引用
No.4547-2 - 2007/07/16 (月) 10:57:19 - 一産婦人科医
サザンで一番重要なのは、重石の乗せ方とバッファーを吸い取るための紙です。
その次にプローブの出来です。
（酵素切断はもちろん重要ですが、まあそれはすぐに確認できるでしょう）
プローブの洗浄条件検討にはnon-RIは向いていません。

non-RI southern 削除/引用
No.4547-1 - 2007/07/14 (土) 17:22:31 - skawasa
今度genomic southernを行います。

biotin High primeでランダムラベルしたプローブ（ゲル切り出し精製した500bpのPCR産物1マイクログラムを鋳型にしました）を使って10マイクログラムのゲノム（制限酵素処理）に対してハイブリしようと思っています。non-RIのサザンは感度が良くないと聞きますが、ご経験のある方はこの系で感度が十分かどうか教えて頂けますでしょうか？ちなみにターゲットはduploid genomeあたり１か２コピーと推察されます。ランダムラベルだからコピーあたりのシグナルは高いとやや楽観しているのですが。
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