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免疫組織染色での染色ムラ トピック削除
No.4539-TOPIC - 2007/07/13 (金) 11:13:45 - 6256
いつも興味深く拝見しております。
免疫組織染色について、ご意見を伺いたいと思います。

組織での核内リン酸化蛋白の免疫染色をしているのですが、
標本の辺縁ではうまく核が染まるのに対し、標本中央部では染まりません。
同じ腫瘍内なので、腫瘍全体の核が染まるはずなのですが・・・。

肉眼上、標本辺縁だけが剥がれている様子はありません。
同じ手技で、他のタンパクを認識する抗体ではムラなく染まっています。

ホルマリン固定、パラフィン包埋標本から5umで薄切したものを、
マイクロウェーブで抗原賦活し、0.3%過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼ
失活させています。Vector Labo. Vactastain ABCキットを使用しています。

改善策などのご意見ございましたら、御教示いただきたいと存じます。
宜しくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.4539-7 - 2007/07/19 (木) 12:10:05 - 組織
> 別な蛋白を認識する抗体では標本全体的に染まる
これは核内抗原ですか？細胞質内蛋白は残っていて、核内蛋白だけがだめになっているという可能性もあると思います。
もし抗体をお持ちなら、ほかの核内抗原で染まり具合を確認されてみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.4539-6 - 2007/07/18 (水) 20:27:28 - Ｔ
見えているものが事実で、中心部に抗原が少ないということはないですか。
例えば腫瘍を摘出して浸潤固定しているなら、中心部まで固定液が浸透するには時間がかかり、その間に細胞死か何かのプロセスが進んで対象蛋白の脱リン酸化が起こるとか。
あるいはそもそも元の腫瘍で辺縁部と中心部で細胞増殖に差があり、リン酸化蛋白はそれを反映しているとか、可能性は色々考えられると思います。

腫瘍を固定後に分割して染色してみてはいかがでしょうか。染色の手技上の問題なら、分割してもやはり切片の周辺部がぐるりと染まるはずですが、元々の固定組織で抗原分布に差があるなら分割面に相当する辺は染まらず、半円状の染色になると予想されます。
前者のように浸潤固定の問題なら、灌流固定に変えれば改善するかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.4539-5 - 2007/07/18 (水) 19:53:15 - 6256
めがねさん、ご意見ありがとうございます。

別な蛋白を認識する抗体では標本全体的に染まるので、
固定が原因ではないと考えています。

一次抗体も、濃度、希釈液、インキュベート時間など
いろいろ条件かえてやってみてはいるのですが・・・。
4℃ overnightでも試してますが、ムラは変わりませんでした。

(無題) 削除/引用
No.4539-4 - 2007/07/15 (日) 12:01:35 - めがね
染色むらがでる原因として、固定が中央部では悪いといううことはないでしょうか？

あと、４℃で一次抗体をOver　night　させてみるといいかもしれないですよ。

(無題) 削除/引用
No.4539-3 - 2007/07/13 (金) 15:14:25 - 6256
千さん、ありがとうございます。

湿潤室は使用しています。
また、標本は乾燥させないようにはしているつもりです。

一次抗体の量は確かに少量かもしれません。
（プレパラート１枚に200uL）
見た目では標本を十分に覆えていたので、
問題ないかと考えていました。

抗体をケチらず、使用量を増やして一度染めてみようと思います。

可能性としては 削除/引用
No.4539-2 - 2007/07/13 (金) 11:45:45 - 千
染色ムラが出来る可能性としては、一次抗体の濃縮などがまず思いつくところです。
湿潤室は使っていますか？抗体の量は充分ですか？
抗体が少ない場合、辺縁に近い部分から濃縮が起こり、濃度が上がって、辺縁のあたりだけ濃く染まる現象が起こります。
あとは、切片を再水酸化後、再び乾かしてしまうとムラの原因になります。
いかがでしょうか？

免疫組織染色での染色ムラ 削除/引用
No.4539-1 - 2007/07/13 (金) 11:13:45 - 6256
いつも興味深く拝見しております。
免疫組織染色について、ご意見を伺いたいと思います。

組織での核内リン酸化蛋白の免疫染色をしているのですが、
標本の辺縁ではうまく核が染まるのに対し、標本中央部では染まりません。
同じ腫瘍内なので、腫瘍全体の核が染まるはずなのですが・・・。

肉眼上、標本辺縁だけが剥がれている様子はありません。
同じ手技で、他のタンパクを認識する抗体ではムラなく染まっています。

ホルマリン固定、パラフィン包埋標本から5umで薄切したものを、
マイクロウェーブで抗原賦活し、0.3%過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼ
失活させています。Vector Labo. Vactastain ABCキットを使用しています。

改善策などのご意見ございましたら、御教示いただきたいと存じます。
宜しくお願い致します。
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