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Fura2のコントロールの取り方 削除/引用 No.4534-7 - 2007/07/18 (水) 23:28:54 - ぴのぴの 返信ありがとうございます。 以前のコメントにあったゼラチンでもかなりはりつき具合に改善が見られ、assayに持ち込むことができるようになりました。PEIも検討してみたいと思います。 すまさんは以前Fura2を用いて測定をされていたとのことですが、Fura2を用いた場合、コントロールの蛍光強度比は抑えることができましたか？ 私は、現在、某物質をaasayの途中でinjectionし、340nm/380nmの比率の上昇をカイネティクスで測定を試みているのですが、Bufferのinjectionでもピークが生じ、アッセイの精度を上げることができず困っています。 細胞内のカルシウム流入は何かと不安定なので、いろいろな要因で流入が引き起こされるようですが、controlなどをどのようにとったか、良かったらご助言下さいm(--)m

polyethyleneimineを使っていました 削除/引用 No.4534-6 - 2007/07/14 (土) 12:48:29 - すま HEK293tを使ってfura-2, fluo-3イメージングを行っていました。コート無しの状態では色々な操作でかなりはがれてしまったため、トランスフェクションやイメージングの時にはPEIコートしていました。 方法は、 0.2%のPEI（フィルター滅菌した2%ストック溶液を滅菌ホウ酸バッファーで希釈）をディッシュに入れる ↓ 5分程度放置 ↓ 滅菌水で3回洗浄（ホウ酸バッファーがtoxicなため） ↓ 水を除いて細胞を播く（乾燥させない方が良い） というものです。神経細胞を培養していた時にもPEIでコートしていましたが、その時は1時間くらい（解剖している間）放置していました。 PEIはシグマのもので、値段も安いのでオススメですよ。ただ、洗浄作業が面倒といえば面倒ですが…。

(無題) 削除/引用 No.4534-5 - 2007/07/11 (水) 22:23:29 - ぴのぴの 助言ありがとうございます。 具体的には何μＬくらい入れて、何分くらい浸した後、キムタオルに吸わせていますか？

(無題) 削除/引用 No.4534-4 - 2007/07/11 (水) 15:27:59 - 通りすがり >僕の場合、96穴プレートを用いたいのですが、このゼラチン溶液を各wellに >100μＬくらい張って、ドラフト内などで、揮発させたら良いのでしょうか？？ 揮発させるのはあまりよくありません、 基本的にゼラチンでcoatしたplateは 乾燥させた状態で保存させると効果が下がるようです。 96穴plateなら、使用直前にcoatingするようにして ドラフト内で滅菌したキムタオルなどの上に plateごと逆さにして吸わせてから すぐ細胞を含んだ培地などを入れるようにすれば どのwellも乾燥させなくて済むと思います。

(無題) 削除/引用 No.4534-3 - 2007/07/11 (水) 13:57:19 - ぴのぴの 通りすがりさん、返信ありがとうございます。 0.1%ゼラチン/PBSを試してみます。 僕の場合、96穴プレートを用いたいのですが、このゼラチン溶液を各wellに100μＬくらい張って、ドラフト内などで、揮発させたら良いのでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.4534-2 - 2007/07/11 (水) 12:43:47 - 通りすがり 要するに293がはがれやすいので困ってるということですね。 コラーゲンなどが高くて使えないなら ゼラチンなんかどうでしょう？ 500g=2000円ぐらいなんで、はるかに安いですよ。 0.1%gelatin/PBSでdishなどをちょっとcoatingしておけば はがれやすい細胞とかには有る程度の効果はあります。 293に関してはいつも使ってますし、 それ以外のはがれやすい細胞とかでも良く使ってます。 293とかだと、 軽く洗うぐらいだと一部がはがれるだけで他のはくっついたままだが、 強く洗うと全部はがせるぐらいの接着力になるはずです。 まあ接着力はコラーゲンとかフィブロネクチンとかにに比べれば明らかに 劣りますが、ほとんどの場合問題ないです。 あとなんといっても安いし簡単ですから。

Fura 2を用いたHEKのアッセイ系が確立できません！ 削除/引用 No.4534-1 - 2007/07/11 (水) 12:25:53 - ぴのぴの 細胞内カルシウム流量を測定するスクリーニング系を立ち上げるために、Fura2-AMを用いたアッセイ系を立ち上げようとしているのですが、うまくいきません…。 トランスフェクション効率が良い＆カルシウム流入ピークが鋭利という２つの利点から、HEK293細胞を用いているのですが、HEK293ははがれやすいという性質があります…。 96穴プレートを用い、蛍光プレートリーダーに供じているのですが、Fura2処理をする前のPBSやHEPESによる洗浄操作や、Fura2-AMを細胞内に取り込ませるためのincubateの間にHEK293細胞がはがれてしまい、アッセイに持ち込めないという問題が生じて悩んでいます。 予算の問題から、コラーゲンコートの96穴ディッシュの使用は避けたいと考えています。培地に安定型アスコルビン酸を加えたりもしましたが、問題は解決されません。 HEK293がはがれないようにFura2を使用する方法が分かる方、是非助けてください。 実際にFura2やHEKを用いている方は勿論、少しでも情報のある方、情報提供よろしくお願いします。

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